慢性自發(fā)性蕁麻疹抗IgE高親和力受體自身抗體檢測(cè)方法研究

徐　婷，易中梅，羅軍梅，張　強(qiáng)，孟　強(qiáng)，喻荷蓮，王世春，蔣天倫

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，重慶 400038)

慢性自發(fā)性蕁麻疹(CSU) 是一種常見(jiàn)易復(fù)發(fā)的皮膚疾病，在任何年齡段均可發(fā)生，其臨床癥狀表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的水腫性紅斑、風(fēng)團(tuán)，常伴劇烈瘙癢，給患者的日常生活造成了嚴(yán)重影響[1-3]。然而，這類蕁麻疹的發(fā)生卻難以找到確切的病因或誘發(fā)因素，這為CSU的臨床治療帶來(lái)了不便和困難[4-6]。現(xiàn)有的研究表明，CSU的發(fā)生與抗人IgE高親和力受體(FcεRIα)自身抗體存在密切的關(guān)系，但在臨床上卻未開(kāi)展對(duì)該自身抗體的檢測(cè)[7-9]。因此，本研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù)制備人FcεRIα的單鏈抗體(scFv)并建立抗人FcεRIα自身抗體的快速檢測(cè)方法，為慢性自發(fā)性蕁麻疹的臨床治療提供有效的診斷依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器噬菌體隨機(jī)線性12肽庫(kù)(Ph.D.TM-12 Phage Display Peptide Library)，其滴度為1.0×1013噬菌斑形成單位(pfu)/mL；大腸桿菌E.coli ER2738、ER2766；測(cè)序引物(-96 g Ⅲ sequeneing primer)序列為 5′-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′，均購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs 公司；抗人FcεRIα抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗人IgG均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；噬菌體單鏈DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；Superdex 75層析柱購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sorval公司；Biologic LP層析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Hofer ΜV-25紫外透射儀購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;VT-1300L超凈工作臺(tái)購(gòu)自成都蘇凈科學(xué)器材有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博泰科學(xué)器材有限公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集本研究經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意，從本院收集健康者和CSU患者標(biāo)本各30例。CSU患者入組前需接受自體血清(50 μL)注射測(cè)試，以0.1 mg/mL的組胺和0.9%的生理鹽水分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。注射30 min內(nèi)，若風(fēng)團(tuán)直徑>1.5 mm者為陽(yáng)性反應(yīng)，方可入組。若風(fēng)團(tuán)直徑≤1.5 mm者為陰性反應(yīng)，不可入組。

1.2.2scFv的生物淘選在96孔板中加入50 μg/mL抗人FcεRI抗體溶液于4 ℃孵育過(guò)夜→加入封閉液于4 ℃孵育2 h→TBST洗滌→加入2×1011pfu噬菌體溶液于室溫孵育1 h→TBST洗滌→加入洗脫液(0.2 mol/L,pH2.2,Glycine-HCl)及中和液(1 mol/L，pH9.1，Tris-HCl)→取1 μL測(cè)滴度并將剩余液體擴(kuò)增→擴(kuò)增液于4 ℃ 12 000×g離心10 min→取80%上清液至新管中，加入1/6體積的2.5 mol/L、NaCl/20% PEG-8000(w/v)于4 ℃靜置過(guò)夜→次日于4 ℃ 12 000×g離心15 min，去上清液→1 mL TBS重懸沉淀，重復(fù)離心1次→取上清液至新管中并加入1/6體積的PEG/NaCl冰浴1 h→4 ℃ 12 000×g離心10 min，去上清液→用含0.01% NaN3的TBS重懸沉淀→取1 μL測(cè)滴度，剩余液體用于下輪篩選。三輪篩選后，在菌斑數(shù)<100的平板上隨機(jī)挑取48個(gè)分隔良好的噬菌斑按1.2.3的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3噬菌體的擴(kuò)增將ER2738的過(guò)夜培養(yǎng)物用LB培養(yǎng)基進(jìn)行1∶100稀釋，按每管1 mL分裝于50 mL的培養(yǎng)管中。用無(wú)菌牙簽蘸取48個(gè)分隔良好的藍(lán)色噬菌斑分別放入上述培養(yǎng)管中，37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)4.5 h。將擴(kuò)增好的噬菌體液體倒入離心管中，12 000×g離心1 min，重復(fù)1次。取80%的上清液于新離心管中，即為擴(kuò)增的噬菌體液體。

1.2.4噬菌體陽(yáng)性克隆的選擇將噬菌體抗體加入96孔板中，加入2倍體積的封閉液(5 mg/L BSA)混勻，于室溫靜置30 min。取100 μL加入已包被抗人FcεRIα抗體的板條中，加底物TMB溶液顯色15 min，以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定吸光值(A值)。設(shè)立1% BSA的包被孔為陰性對(duì)照，以A450值高于陰性對(duì)照2倍以上為陽(yáng)性克隆。

1.2.5scFv序列測(cè)定將陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，按照噬菌體單鏈DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行操作，提取陽(yáng)性克隆的DNA，采用1.1中的測(cè)序引物送上海生工公司測(cè)序。

1.2.6scFv的制備和純化將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株ER2766中大量表達(dá)，通過(guò)Biologic LP層析系統(tǒng)對(duì)scFv進(jìn)行純化并進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)鑒定。

1.2.7抗人FcεRIα自身抗體的檢測(cè)將scFv 50 ng/mL 100 μL包被于ELISA板上，4 ℃過(guò)夜并封閉，于板孔中加入1∶100稀釋的健康者和患者血清標(biāo)本，37 ℃孵育30 min；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗人IgG(1∶1 000) ，37 ℃孵育30 min；洗板后，每孔加入TMB 顯色液100 μL，于37 ℃避光顯色20 min，加入50 μL H2SO4(2 mol/L)，于20 min內(nèi)測(cè)定A值。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò)受試者工作特征(ROC)曲線確定檢測(cè)的臨界(cut off)值、特異度及靈敏度。

2　結(jié)　　果

2.1噬菌體12肽庫(kù)的生物淘選結(jié)果通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)篩選技術(shù)，不但可以將目標(biāo)分子從庫(kù)中準(zhǔn)確篩選得到，而且通過(guò)3輪擴(kuò)增可以將目標(biāo)分子進(jìn)行富集。從表1可以看到，隨著淘選輪數(shù)的增加，噬菌體產(chǎn)量也在增加，這說(shuō)明與抗人FcεRIα抗體結(jié)合的噬菌體得到了富集。

表1　　噬菌體12肽庫(kù)的生物淘選結(jié)果(pfu)

2.2噬菌體陽(yáng)性克隆的檢測(cè)隨機(jī)挑取48個(gè)分隔良好的藍(lán)色噬菌斑，并依次編號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增純化后，通過(guò)ELISA檢測(cè)篩選得到12個(gè)陽(yáng)性克隆，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　　噬菌體陽(yáng)性克隆ELISA結(jié)果

2.3篩選肽的序列分析按試劑盒說(shuō)明書提取上述12個(gè)陽(yáng)性噬菌體的ssDNA，用-96 gⅢ測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，其中7個(gè)克隆的序列與抗人FcεRIα自身抗體的結(jié)合表位一致。

2.4表達(dá)克隆的選擇將上述克隆分別轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中進(jìn)行表達(dá)，并將純化后的scFv片段加入已包被抗人FcεRIα抗體的板條中進(jìn)行ELISA檢測(cè)。從圖2中可知，A20的A值最高，說(shuō)明它與抗人FcεRIα抗體的結(jié)合力最強(qiáng)，故選定A20為表達(dá)克隆。

圖2　　噬菌體陽(yáng)性克隆ELISA結(jié)果

2.5抗人FcεRIα自身抗體的檢測(cè)將A20轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中大量表達(dá)純化后，將scFv片段包被于ELISA 板上測(cè)定健康者和CSU患者血清中的抗人FcεRIα自身抗體，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　　檢測(cè)抗人FcεRIα自身抗體結(jié)果

2.6ROC曲線分析將CSU患者的ELISA檢測(cè)值作ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)A值為0.635時(shí)，該檢測(cè)方法的靈敏度為96.7%，特異度為100.0%，見(jiàn)圖4。

圖4　　ROC曲線分析結(jié)果

3　討　　論

CSU給患者的日常生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的影響，但至今對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，并且難以找到確切的病因或誘發(fā)因素，從而加大了臨床治療的難度[10-11]。傳統(tǒng)的研究認(rèn)為蕁麻疹的發(fā)生是屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，與IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞活化，進(jìn)而釋放組胺、白三烯等活性物質(zhì)有關(guān)。肥大細(xì)胞是IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。在蕁麻疹疾病中，活化的肥大細(xì)胞主要通過(guò)釋放組胺及多種細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)發(fā)揮作用[12]。然而，這種發(fā)病機(jī)制多見(jiàn)于急性蕁麻疹，少見(jiàn)于慢性蕁麻疹。

在部分慢性蕁麻疹患者皮內(nèi)注射自體血清后，注射部位周圍可出現(xiàn)紅斑和風(fēng)團(tuán)。由此表明，其血清中可能存在某些自身抗體能活化肥大細(xì)胞，從而釋放活性物質(zhì)，導(dǎo)致CSU的發(fā)生。這一研究發(fā)現(xiàn)提示具有功能性的自身抗體與CSU的發(fā)病存在著密切的關(guān)系[13-14]。隨著研究的不斷深入，在CSU患者血清中純化的IgG 片段可以在體外誘導(dǎo)組胺的釋放，并且這類IgG 抗體主要是針對(duì)IgE高親和力受體α 鏈(FcεRIα) 的自身抗體，從而證實(shí)當(dāng)IgG-抗FcεRI和IgG-抗IgE結(jié)合FcεRI或IgE后通過(guò)激活補(bǔ)體C5a促使肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放組胺，導(dǎo)致蕁麻疹的發(fā)生[15]。因此，抗FcεRIα自身抗體的診斷對(duì)CSU在臨床治療過(guò)程中具有重要的指導(dǎo)意義。

目前，國(guó)內(nèi)在臨床上尚未出現(xiàn)抗FcεRIα自身抗體的商品化診斷試劑盒，嚴(yán)重影響了由抗人FcεRIα自身抗體所引起的此類疾病的診斷[16]。而現(xiàn)有的研究多數(shù)是先通過(guò)原核表達(dá)的方法獲取FcεRIα蛋白，然后構(gòu)建ELISA檢測(cè)的方法，但是由于原核表達(dá)技術(shù)多表達(dá)的是全長(zhǎng)蛋白，在ELISA檢測(cè)過(guò)程中存在一定的交叉反應(yīng)，從而使該檢測(cè)方法的特異性達(dá)不到預(yù)期[17]。本研究采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)通過(guò)3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”來(lái)大量富積特異性克隆從而獲得人FcεRIα的單鏈抗體。該單鏈抗體屬于全人源性抗體，通過(guò)對(duì)其序列分析及氨基酸殘基的優(yōu)化能明顯提高抗體的親和力，而且獲取過(guò)程簡(jiǎn)便、高效。另外，從本研究結(jié)果中可以看出，利用scFv來(lái)構(gòu)建的抗FcεRIα自身抗體ELISA檢測(cè)的方法，其特異度及靈敏度均較高，為抗FcεRIα自身抗體在臨床上的診斷提供了可靠的理論依據(jù)。