乳腺癌是影響全球女性健康最常見的癌癥，全球女性乳腺癌發(fā)病率和死亡率分別占女性癌癥的25%和15%［1］。雖然隨著診療水平的提高，其發(fā)病率和死亡率均有所改善，但腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）的存在及耐藥性的發(fā)生仍給治療帶來巨大難度［2］。對于復(fù)發(fā)性乳腺癌，耐藥幾乎不可避免，因此了解腫瘤耐藥的分子機制尤為重要。本研究旨在通過探討同源盒基因HOXD3表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集2006年1月至2008年12月于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行乳房切除術(shù)且病理確診乳腺癌的組織標(biāo)本87例。組織標(biāo)本收集后在液氮中冷凍，并儲存于-80℃用于分析。

1.1.2 主要試劑 兔抗人多克隆HOXD3抗體購自美國Santa Cruz公司；兔二抗、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS均購自美國Gibco公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；Li?pofectamine2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法 使用常規(guī)免疫組織化學(xué)方法檢測乳腺癌組織中HOXD3表達(dá)。組織蠟塊4 μm切片附于載玻片上，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，于檸檬酸中高溫高壓修復(fù)，滴加抗HOXD3抗體，4℃孵育過夜。滴加生物素標(biāo)記二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，甘油凝膠封片。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和處理 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435。取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞，使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10天后，光鏡下觀察細(xì)胞球，測量、計數(shù)、拍照。從MDA-MB-231 mRNA中擴增HOXD3 cDNA，將其克隆至pcDNA3.1載體中，生成HOXD3過表達(dá)質(zhì)粒。Lipofectamine2000根據(jù)說明書用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后使用不同劑量順鉑或阿霉素處理乳腺癌細(xì)胞，檢測其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 RT-PCR檢測 使用TRIzol提取總RNA，Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA。分別擴增目的基因和對照內(nèi)參β-actin，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃15min、94℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s，40個循環(huán)，95℃ 15 s、60℃15 s、95℃15 s以驗證PCR產(chǎn)物的特性。采用Sequence Detector System 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算相關(guān)基因的相對表達(dá)量，使用引物見表1。

表1 基因及引物序列

1.2.4 Western blot檢測 使用蛋白裂解液在4℃裂解細(xì)胞30 min，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，分別加入一抗，4℃過夜，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h；洗膜后加ECL試劑，將PVDF膜放入X線暗盒，壓片，顯影，定影。使用GD5800分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.5 免疫熒光染色法 細(xì)胞在蓋片上生長融合到85%時，從孵箱中取出；PBS洗滌后用4%甲醛固定20 min；5%BSA室溫封閉30 min；加入抗HOXD3抗體于4℃溫育過夜；PBS洗滌后，加二抗室溫孵育30 min；DAPI核染色后封片。

1.2.6 MTT法 收集對數(shù)生長期MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103/mL，取500 μL接種于96孔培養(yǎng)板，分別在第0、1、2、5、6天每孔加入濃度為5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃溫育4 h后移除上清，加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），590 nm波長處測定吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析（ANO?VA）進(jìn)行序列分析，非配對t檢驗進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXD3在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

圖1 87例乳腺癌組織和癌旁正常組織及乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7中HOXD3的mRNA和蛋白表達(dá)水平

本研究發(fā)現(xiàn)，HOXD3在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435和MCF-7中的蛋白或基因表達(dá)水平，均顯著高于癌旁正常組織及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A（均P＜0.05，圖1）。提示HOXD3在乳腺癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)可能對乳腺癌惡性生物學(xué)行為的維持起重要作用。

2.2 HOXD3在乳腺癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)及對耐藥性的影響

本研究分別建立了對順鉑或阿霉素耐藥的細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435，檢測發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞系的IC50分別為（20.82±0.05）μmol/L和（19.69±0.47）μmol/L，或（32.26±0.23）mmol/L和（26.08±0.55）mmol/L，均高于對應(yīng)原細(xì)胞系（均P＜0.05），MDA-MB-231細(xì)胞的IC50更高，耐藥倍數(shù)分別為2.47和3.10倍，或1.86和2.08倍（圖2A）。采用RT-PCR法及免疫熒光染色法檢測HOXD3在耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞系中HOXD3的表達(dá)水平均明顯高于原始細(xì)胞（均P＜0.05，圖2B～D）。使用HOXD3過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原始MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HOXD3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增高（均P＜0.01，圖3A～B），隨后使用順鉑或阿霉素處理，MTT法和集落形成實驗表明，HOXD3過表達(dá)的MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞活力及集落形成能力顯著增加（均P＜0.05，圖3C～F）。

圖2 順鉑或阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435中HOXD3表達(dá)

圖3 乳腺癌耐藥細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435中HOXD3表達(dá)及對耐藥性的影響

2.3 HOXD3對乳腺癌細(xì)胞干性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞中HOXD3表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致腫瘤球體數(shù)目顯著增加（均P＜0.05，圖4A），HOXD3過表達(dá)的MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞中，乳腺癌干細(xì)胞的生物標(biāo)記物CD133、Nanog、Oct4和SOX2等的表達(dá)水平顯著增加（均P＜0.05，圖4B～D），HOXD3表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖（圖4E）。

圖4 HOXD3對乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞干性的影響

3 討論

既往的研究提示，乳腺癌干細(xì)胞是產(chǎn)生化療耐藥，造成乳腺癌復(fù)發(fā)的根源［3］。本研究結(jié)果提示，HOXD3過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞干性維持及耐藥性的產(chǎn)生發(fā)揮重要的作用，HOXD3在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞系中的基因或蛋白水平顯著高于癌旁正常組織及正常乳腺細(xì)胞。HOXD3可促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，并對乳腺癌干細(xì)胞自我更新能力的維持起著重要的作用。此外，本研究還證實HOXD3表達(dá)可促使乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生多重耐藥。CSCs是腫瘤細(xì)胞內(nèi)一小群具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細(xì)胞，大量證據(jù)支持CSCs引起化療耐藥的理論，CSCs對常規(guī)放化療表現(xiàn)出強烈的抵抗能力，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的根源［4-6］。耐藥分為固有耐藥及獲得性耐藥，或兩者兼有。固有耐藥可能與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial mesenchymal tran?sition，EMT）、CSCs自然靜止傾向、DNA修復(fù)能力增強，以及ATP-結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運蛋白高表達(dá)從而導(dǎo)致藥物外流等因素有關(guān)［5］。獲得性耐藥則可能與治療過程中存活的干細(xì)胞亞群累積突變，產(chǎn)生耐藥表型有關(guān)［7］。CSCs介導(dǎo)化療耐藥的機制尚未完全明確，目前已知多種信號通路Hedge?hog、JAK/STAT3、TGF-β、Wnt/β-catenin等可能在乳腺癌干細(xì)胞介導(dǎo)的化療耐藥過程中發(fā)揮重要作用［8-10］。

HOX基因家族是一個高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，在正常生理發(fā)育過程中，HOX基因家族調(diào)控所有多細(xì)胞生物體形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分化［11］。此外，HOX基因家族在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤的預(yù)后及分期密切相關(guān)［12-13］。HOXD3是哺乳動物四種同源盒基因簇之一，在正常成人組織中的表達(dá)具有時間特異性及組織特異性，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞運動和細(xì)胞間相互作用維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性［14］。Miyazaki等［12］研究表明，在人紅白血病和肺癌細(xì)胞中，HOXD3高表達(dá)可增加TGF-β依賴性和非依賴性信號通路的活性，增強癌細(xì)胞的運動能力和侵襲能力。本課題組既往的研究證實，HOXD3高表達(dá)乳腺癌患者的5年無進(jìn)展生存及總生存顯著低于HOXD3低表達(dá)者，HOXD3是乳腺癌預(yù)后不良的獨立危險因素［13］。本研究進(jìn)一步證實，HOXD3不僅對乳腺癌細(xì)胞干性的維持起重要的作用，同時參與乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生，針對該分子及其下游通路的靶向治療，可能從根本上抑制乳腺癌細(xì)胞自我更新能力，并恢復(fù)其對化療藥物的敏感性，從而提高乳腺癌患者的預(yù)后。

HOXD3究竟通過何種分子通路發(fā)揮其惡性生物學(xué)效應(yīng)，需要進(jìn)一步探討。研究發(fā)現(xiàn)，HOXD3表達(dá)與整合素β3呈正相關(guān)［15］。整合素β3為細(xì)胞表面受體整合素家族成員，通常與整合素αν和β亞單位形成二聚體，表達(dá)于細(xì)胞表面，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用［16］。此外，整合素β3在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生惡性生物學(xué)行為［17］。HOXD3是否通過調(diào)節(jié)整合素β3表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮作用的假設(shè)，有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究證實HOXD3表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的影響，及HOXD3表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥的產(chǎn)生，為更好地認(rèn)識乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性，更好地理解乳腺癌耐藥的分子機制，制定逆轉(zhuǎn)化療耐藥的靶向治療提供潛在靶點。

（2018-02-26收稿）

（2018-06-12修回）