席加喜　張華君　陳曉宇

[摘要] 目的 觀察丹參酮ⅡA（TSⅡA）對萬古霉素（VAN）損傷的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能機(jī)制。 方法 體外傳代培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)約為1×106個/mL，分為空白組、VAN組、TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組，除空白組加入PBS溶液外，其他各組加入終濃度為100 μg/L VAN建立VAN損傷HK-2細(xì)胞模型，培養(yǎng)24 h后，空白組、模型組加入等體積的PBS溶液，TSⅡ-A各劑量組分別加入不同濃度的TSⅡA，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MTT法測定細(xì)胞存活率，比色法測定細(xì)胞懸液中乳酸脫氫酶（LDH）、過氧化氫酶（CAT）活性；熒光素DCFH-DA探針法測定細(xì)胞內(nèi)ROS含量，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 與空白組比較，VAN組細(xì)胞存活率、CAT活性顯著降低，LDH活性和細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P < 0.05）；與VAN組比較，TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組的細(xì)胞存活率、CAT活性顯著升高，LDH活性和細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯減少（P < 0.05），且作用均有濃度依賴性。 結(jié)論 TSⅡA磺酸鈉注射液能顯著提高VAN損傷HK-2細(xì)胞的存活率，減少VAN損傷的HK-2細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與降低VAN損傷HK-2細(xì)胞LDH水平和細(xì)胞內(nèi)的ROS水平及升高CAT等氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 萬古霉素；丹參酮ⅡA；細(xì)胞凋亡；機(jī)制；HK-2細(xì)胞

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（b）-0008-04

Effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Injection against HK-2 apoptosis induced by Vancomycin and the probable mechanism

XI Jiaxi ZHANG Huajun CHEN Xiaoyu

Department of Pharmacy， the People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China

[Abstract] Objective To explore the effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Injection against HK-2 cell damage induced by Vancomycin and the probable mechanism. Methods HK-2 cells were cultured in vitro till the number was up to 1×106 /mL， randomly divided into five groups： control group， VAN group， low dose group of TSⅡA Sulfonate Injection， middle dose group of TSⅡA Sulfonate Injection， hight dose group of TSⅡA Sulfonate Injection. Except for the control group adding PBS， other groups were added 100 μg/L VAN for 24 hours. Then， the control group and VAN group were respectively added to the same volume of PBS， and the high dose group， middle dose group and low dose group of TSⅡA respectively added to different concentrations of TSⅡA. The cell viability was detected with MTT method， the activity of LDH were measured and the cell viability was detected with the content of LDH. DCFH-DA was used as the fluorescence probe to detect the level of ROS by a fluorescence microplate reader. Annexin V-FITC/PI double dyeing method was used to detect apoptosis rate. Results Compared with the control group， the survival rate of the cells and the activity of CAT were decreased， meanwhile the level of ROS， the activity of LDH and apoptosis rate were increased in the VAN group （P < 0.05）. Compared with the VAN group， the survival rate of the cells and the activity of CAT were increased， meanwhile the level of ROS， the activity of LDH and apoptosis rate were decreased in the low， middle and hight dose group of TSⅡA Sulfonate Injection （P < 0.05）， and there was a concentration dependence. Conclusion TSⅡA Sulfonate Injection can promote the proliferation of HK-2 cells in vitro， and improve the biochemical parameters and enzyme levels. The results suggest that TSⅡA Sulfonate Injection has a protective effect on HK-2 cell， and the protective mechanisms may be related with its antioxidant effect.

[Key words] Vancomycin； TanshinoneⅡA； Cell apoptosis； Mechanism； HK-2 cell

萬古霉素（Vancomycin，VAN）是一種糖肽類抗生素，通過阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而具有強(qiáng)大的抗菌作用，是治療革蘭陽性菌感染的主要藥物，臨床主要用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染[1-2]。該藥具有一定的腎毒性、耳毒性，個體差異較大，且治療指數(shù)小[3-4]，腎毒性是其劑量限值性毒性，目前臨床多采用調(diào)整給藥劑量和監(jiān)測血藥濃度的方法來減少VAN腎損害[5]，但即使嚴(yán)格按照肌酐清除率給藥和監(jiān)測血藥濃度，仍有很多患者發(fā)生腎功能損傷，并不能使每一位患者獲益。丹參酮Ⅱ-A（tanshinon Ⅱ-A，TSⅡA）是唇形科植物丹參的脂溶性主要有效成分之一[6]，其具有抗炎抑菌[7]、清除自由基與抗氧化作用[8]、保肝及改善肝功能、抗癌、改善血循環(huán)等藥理作用[9]，研究表明，其對各種類型的急慢性腎衰竭具有保護(hù)作用[10-12]。本研究擬以HK-2細(xì)胞為研究模型，研究丹參酮ⅡA對VAN損傷的HK-2氧化指標(biāo)和細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制，以確定TSⅡA對VAN腎損傷的療效，為開發(fā)TSⅡA新的藥理作用及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

721型分光光度計（上海分析儀器總廠）；2323-2型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Shellab公司），EPICS X2型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），BIORAD550型酶聯(lián)免疫測定儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用萬古霉素（禮來蘇州制藥有限公司，批號：C467438，規(guī)格：每支500 mg）；TSⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：1503022，規(guī)格：10 mg/5 mL）；細(xì)胞培養(yǎng)新生小牛血清（美國Hyclone公司，批號：DQAO194），DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：1177845）；四甲基偶氮唑藍(lán)MTT（美國Sigma公司，批號：M2128）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物）；DCFH.DAROS檢測試劑盒（杭州碧云天公司。批號：20160802）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160723）。

1.3 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)

人腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)條件：5% CO2培養(yǎng)箱，pH 7.4，37℃，10%新生牛血清，DMEM培養(yǎng)液。根據(jù)生長狀況每2～3天消化換液傳代培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

取上述培養(yǎng)的處于對數(shù)期的HK-2細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)約為1×106個/mL），接種于6孔培養(yǎng)板，分為空白組、VAN組、TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組，除空白組外其他各組均加入含終濃度為100 μg/L VAN培養(yǎng)液制造VAN損傷模型，培養(yǎng)24 h后，空白組和模型組加入20 μl的PBS溶液，TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組分別加入15、30、60 μg/mL的TSⅡA 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.5顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

按上述“1.4”方法繼續(xù)處理48 h后，棄上層培養(yǎng)液，PBS沖洗3～5次，加入正常培養(yǎng)液約10 mL，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞輪廓形態(tài)。

1.6 MTT法測定細(xì)胞存活率

按上述“1.4”方法繼續(xù)處理24 h及48 h，按MTT法操作流程和步驟測定細(xì)胞存活率。紫外分光光度計下測定吸光度（A）值，檢測條件為：檢測波長490 nm，參比波長630 nm，結(jié)果以存活率表示，計算公式為存活率=（A實(shí)驗(yàn)組/A空白組）×100%。每次實(shí)驗(yàn)平行監(jiān)測2塊板，重復(fù)3次[13-14]。

1.7 比色法測定細(xì)胞懸液中的LDH、CAT活性

按上述“1.4”方法分組和處理24 h，加細(xì)胞裂解液裂解，3000 r/min離心10 min（離心半徑為60 cm），棄上清液，按試劑盒測LDH、CAT含量。LDH、CAT活性均采用比色法，每次實(shí)驗(yàn)平行檢測2塊板，重復(fù)3次。

1.8 熒光素DCFH-DA探針法測定細(xì)胞內(nèi)ROS含量

按上述“1.4”方法分組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，參照ROS劑盒說明書，裝載DCFH-DA探針，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min后予PBS緩沖液洗滌細(xì)胞5次，除盡游離的DCFH-DA，多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量，檢測條件：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。結(jié)果以比值表示，計算公式為ROS含量比值=實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值[13-14]。每次實(shí)驗(yàn)平行監(jiān)測2塊板，重復(fù)3次。

1.9 Annexin V- FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

按上述“1.4”方法分組處理48 h，經(jīng)胰酶消化后離心，并以PBS 3～5次清洗重懸，去除培養(yǎng)基。按照細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)操作，在Binding Buffer懸浮細(xì)胞后加入5 μL Annexin-FITC振動30 s混勻，加入5 μL PI室溫避光條件下反應(yīng)15 min，取反應(yīng)液上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSⅡA對VAN損傷HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高倍光學(xué)顯微鏡下，空白組細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則的島嶼狀，細(xì)胞布滿整個板區(qū)，可見梭狀細(xì)胞融合成片，并見多處復(fù)層生長：VAN組細(xì)胞明顯萎縮，成不規(guī)則狀，鏡下細(xì)胞數(shù)量明顯減少；TSⅡAL、TSⅡAM、TSⅡAH組細(xì)胞數(shù)量均有不同程度增加，但仍明顯少于空白組。見圖1（封四）。

2.2 TSⅡA對VAN損傷HK-2細(xì)胞存活率的影響

存活率實(shí)驗(yàn)顯示，VAN造模處理后，HK-2細(xì)胞存活率均顯著降低，且隨著時間延長存活率進(jìn)一步降低，且具有時間效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與VAN組比較，TSⅡA各組細(xì)胞存活率均出現(xiàn)不同程度的升高，TSⅡA L、TSⅡA M、TSⅡA H劑量組隨著TSⅡA濃度的增加，存活率逐漸增加，具有一定濃度效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 TSⅡA對VAN損傷HK-2細(xì)胞懸液中LDH、CAT活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VAN損傷后，各組LDH活性均顯著增高，CAT活性均顯著降低，VAN組LDH活性比空白組高出近4倍，CAT活性比空白組降低近1/2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。給予TSⅡA干預(yù)后，TSⅡA各劑量組LDH均有不同程度降低，CAT有不同程度升高，改善程度具有濃度效應(yīng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 TSⅡA對VAN損傷HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，VAN組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，且數(shù)值上升近2倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與VAN組比較，TSⅡA各劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS水平出現(xiàn)不同程度下降，且隨著TSⅡA濃度的增加，下降作用更明顯，表現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.5 TSⅡA對VAN損傷HK-2細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，VAN作用于HK-2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的凋亡率為89.6%，較空白組明顯增加，TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組分別為79.3%，65.6%，58.1%，較模型組顯著降低（P < 0.05），且具有濃度效應(yīng)。見圖3。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，VAN進(jìn)入體內(nèi)后，可導(dǎo)致體內(nèi)生成過多的活性氧自由基，氧自由基是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性甚至是DNA損傷的重要原因，最終通過一系列的反應(yīng)導(dǎo)致腎臟細(xì)胞損傷[15-16]。故此，研究者進(jìn)一步深入研究了一些具有抗氧化作用的藥物對VAN腎損傷的保護(hù)作用。Ocak等[17]研究發(fā)現(xiàn)在維生素E、維生素C、N-乙酰半胱氨酸、咖啡酸苯乙酯聯(lián)用VAN治療過程中，維生素E對VAN腎毒性的保護(hù)效應(yīng)最強(qiáng)。研究表明，丹參酮ⅡA能有效抑制細(xì)胞內(nèi)過氧化產(chǎn)物對DNA的損傷，其保護(hù)作用可能是通過清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，從而阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)而抑制DNA加成物的生成以減少細(xì)胞毒性[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，TSⅡA能有效地增加VAN損傷的HK-2細(xì)胞的生存率，明顯降低VAN損傷細(xì)胞LDH活性和細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并提高細(xì)胞懸液中CAT活性，且作用表現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)。表明TSⅡA有效地減低了VAN損傷HK-2細(xì)胞內(nèi)的氧化反應(yīng)。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示TSⅡA有效降低VAN誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的凋亡率，且在實(shí)驗(yàn)設(shè)計的度范圍內(nèi)具有劑量依賴性。由此可推斷TSⅡA可能通過降低HK-2細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)，從而減輕細(xì)胞凋亡，從而對VAN損傷的HK-2細(xì)胞起到保護(hù)作用。本課題組前期研究還證實(shí)TSⅡA磺酸鈉注射液能有效的降低VAN損傷大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善損傷大鼠的腎功能，減輕腎臟的病理變化，對VAN損傷大鼠氧化指標(biāo)和腎功能均具有改善作用[11]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和前期研究結(jié)果，可推斷氧化應(yīng)激反應(yīng)是VAN腎損傷的可能機(jī)制，而TSⅡA則可通過清除細(xì)胞的氧自由基以及提高自由基清除酶的活性，而減少細(xì)胞氧化損害，延緩腎臟毒性的發(fā)展進(jìn)程，從而起到保護(hù)VAN損傷的作用。

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（收稿日期：2018-01-15 本文編輯：李岳澤）