張垚 白金峰 徐凱莉 劉寧

摘要：從水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）樹皮、葉片中分離篩選得到了17株形態(tài)各不相同的內(nèi)生真菌，采用對峙培養(yǎng)法篩選對植物病原真菌，層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）﹑禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）﹑玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）﹑玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）具有拮抗作用的菌株，篩選得到了1株對以上4種病原菌具有廣譜抗菌活性的菌株，命名為SS-17。通過對SS-17菌株的形態(tài)特征觀察及ITS分子鑒定，初步鑒定為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

關(guān)鍵詞：水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）；內(nèi)生真菌；篩選；抑菌活性；黑附球菌（Epicoccum nigrum）

中圖分類號：Q939.92 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0036-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.008

Abstract： In this research，17 strains of the endophytic fungi were separated from the leaves and bark of Metasequoia glyptostroboides with different colony morphology，and the strains with antagonistic action were screened by dual culture method against plant pathogenic fungi including Fusarium proliferatum，F(xiàn). graminearum，Setosphaeria turcica，Helminthosporium maydis. 1 strain was obtaind with antagonism to these strains above，named SS-17. With the morphology and ITS molecular identification of SS-17 strain，it was identified as Epicoccum nigrum.

Key words： Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng；endophytic fungus；screening；antibacterial activity；Epicoccum nigrum

水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）是杉科水杉屬植物，是中國獨(dú)有的植物種類。它同時也是一種罕見的植物種類，被稱為“活化石”，它對古植物、古地理等的研究均有重要意義[1]。目前，人們對水杉的生態(tài)習(xí)性、病蟲害防治等方面已經(jīng)進(jìn)行了廣泛深入地研究[2-4]。近些年來，對水杉的生物活性的研究引起了人們的廣泛關(guān)注，2005年樊兵等[5]發(fā)現(xiàn)了水杉具有抗植物病毒的活性。吳光旭等[6]發(fā)現(xiàn)水杉莖葉提取物濃度是0.01 g/mL時，對霜疫霉孢子囊的萌發(fā)抑制率超過50%，并且對香蕉炭疽病菌也有一定的抑制作用。

植物內(nèi)生真菌是指生存在植物組織內(nèi)部或者生活史的某一階段存在于植物組織內(nèi)部，并不會對植物組織致病的一類真菌[7，8]。目前，從已研究過的各類植物中都發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌，對藥用植物中的植物內(nèi)生真菌的研究較多，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生真菌主要為子囊菌類及其無性型，包括腔菌綱、核菌綱等[9-11]。從植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物中分離得到的化合物具有抗菌、殺蟲、抗腫瘤等生物活性[12] 。Guo等[13]從櫟屬（Quercus）植物中分離得到了一株內(nèi)生真菌Cytonaema sp.，其代謝產(chǎn)物可以抑制人巨細(xì)胞病毒蛋白酶的活性，從而達(dá)到抑制感染性人巨細(xì)胞病毒顆粒產(chǎn)生的作用。有些內(nèi)生真菌還能夠產(chǎn)生細(xì)胞壁分解酶，用來克服宿主防御異物的天然屏障，還可以產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶等[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌還能夠產(chǎn)生其他活性物質(zhì)，如免疫抑制劑、降血糖活性物質(zhì)等。

本試驗從水杉樹皮、葉片中分離篩選得到形態(tài)各不相同的內(nèi)生真菌，采用對峙培養(yǎng)法篩選對植物病原真菌層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）﹑禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）﹑玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）﹑玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）具有拮抗作用的菌株，對其進(jìn)行形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定，為植物病害防治提供菌種來源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

PDA培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基。

1.2 樣品采集

2014年5月28日在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)進(jìn)行采集水杉樹皮和葉片。采集部位和方法：用小刀刮取靠近水杉根部約20 cm的樹皮，再用小刀剪取水杉葉片。分別用無菌袋裝好后進(jìn)行編號，用于內(nèi)生真菌的分離或者存于4 ℃冰箱備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 將表面消毒處理后的樹皮及葉片接種于含150 μL氨芐青霉素（ampcilin）的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5 d后，選擇長勢較好的菌絲，挑取菌絲接于新鮮的PDA培養(yǎng)基中，25 ℃倒置培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取不同形態(tài)及位置的單菌落，于PDA培養(yǎng)基25 ℃倒置純化培養(yǎng)，獲得性狀穩(wěn)定的內(nèi)生真菌并編號，在4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定 用CTAB法提取形態(tài)各不相同的菌株的DNA，用ITS（ITS1、ITS4）通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3 拮抗菌活性的測定 采用對峙培養(yǎng)法，在超凈工作臺中，將直徑為5 mm的供試病原真菌的菌塊接種于PDA培養(yǎng)基的內(nèi)部，再將直徑為5 mm的植物內(nèi)生真菌的菌塊接種于供試病原菌的左側(cè)。將只含有供試病原真菌的PDA培養(yǎng)基作為空白對照，25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5 d，測量供試病原菌菌落邊緣和植物內(nèi)生真菌菌落邊緣之間的距離，選擇拮抗作用較明顯的菌株進(jìn)行復(fù)篩和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

將水杉樹皮和葉片表面消毒后，分離植物內(nèi)生真菌。經(jīng)過分離單菌落、純化培養(yǎng)，3代以上得到性狀穩(wěn)定的內(nèi)生真菌，共分離得到17株形態(tài)各不相同的菌株。采用對峙培養(yǎng)法，在超凈工作臺中，將直徑為5 mm的供試病原真菌的菌塊接種于PDA培養(yǎng)基。

2.2 內(nèi)生真菌對病原真菌的拮抗作用及抗菌譜

將從水杉樹皮及葉片中分離純化得到的17株內(nèi)生真菌，通過對峙培養(yǎng)法，篩選對層出鐮刀菌﹑禾谷鐮孢菌﹑玉米大斑病菌﹑玉米小斑病菌4種供試病原真菌具有拮抗作用的菌株，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株SS-17對以上4種病原菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用。

2.3 SS-17菌株的鑒定

SS-17菌株在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃倒置培養(yǎng)下，前期長出棉絮狀白色菌絲，菌絲由中心向邊沿擴(kuò)展生長，呈“V”形，培養(yǎng)5 d后菌絲長滿皿，開始分泌黃褐色分泌物，菌落背面黃褐色，中心呈黑色，菌落的邊緣不整齊，如圖2所示。

在光學(xué)顯微鏡下觀察SS-17菌株的孢子和菌絲的形態(tài)特征，結(jié)果如圖3所示，SS-17菌絲多為無色或呈極淡褐色，分枝少、光滑，菌絲內(nèi)有隔膜，分生孢子梗短小且粗，分生孢子從分生孢子梗頂端膨大的地方生出，分生孢子的顏色初期較淺，后期顏色加深為黑褐色。綜合形態(tài)特征及序列比較，初步鑒定該菌株為半知菌綱殼霉目杯霉科黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

用CTAB法提取SS-17菌株的DNA作為模板，用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收進(jìn)行測序。使用MEGA5.1軟件，按鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。結(jié)果顯示，在水杉中分離得到的SS-17菌株與黑附球菌聚于相同進(jìn)化支。綜合形態(tài)特征及ITS序列比對結(jié)果，鑒定該菌株為黑附球菌（E. nigrum）。

3 討論

黑附球菌屬半知菌亞門附球菌屬，廣泛地存在于土壤、空氣及剛死亡或幼嫩的植物組織表面，還可以作為寄生菌寄生在某些植物病原菌上，如小麥（Cochliobolus sativus）。黑附球菌大多數(shù)沒有致病性，但對沙棘果[15]、小麥[16]有一定的致病力，Hensel[17]和Ohtsubo[18]等認(rèn)為，它可能是一種過敏原，其培養(yǎng)液提取物對小鼠有一定毒性。本試驗從水杉樹皮中分離篩選得到17株內(nèi)生真菌，通過抑菌試驗篩選出SS-17菌株有較強(qiáng)的拮抗作用，利用形態(tài)觀察和ITS分子鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株ITS序列與附黑球菌同源性高，初步鑒定該菌株為黑附球菌。

黑附球菌可以在衰老的或剛死亡的植物組織表面快速地產(chǎn)生分生孢子，并能夠產(chǎn)生可以抗真菌的化合物，因此，它是一種防治農(nóng)作物病害較為理想的生防菌[19]。Liu等[20]試驗結(jié)果顯示，黑附球菌的發(fā)酵液經(jīng)去除多糖后的余液可以抑制病疫霉孢子囊釋放游動孢子。已有研究表明，黑附球菌產(chǎn)生的酶類物質(zhì)的主要作用為降低這些菌類細(xì)胞膜的通透性，或者干擾周圍其他菌類及降解其細(xì)胞壁的化學(xué)成分。

隨著生物技術(shù)迅速的發(fā)展，基因工程技術(shù)等相關(guān)手段被用于篩選耐化學(xué)藥劑、具有高產(chǎn)率的黑附球菌，從而為其開發(fā)和利用提供良好的材料。目前，發(fā)酵體系是黑附球菌的利用基礎(chǔ)，因此摸索并建立適合黑附球菌的不同菌株的發(fā)酵體系，具有很重要的理論和現(xiàn)實意義。關(guān)于生防菌附球菌和病原菌之間的互作機(jī)制還不是很清楚，這對于黑附球菌的生物防治作用的提高極其重要，需要進(jìn)一步深入研究；對其次生代謝產(chǎn)物的分離和提取，也是將來研究的主要方向。

4 結(jié)論

本試驗從水杉葉片及樹皮中分離篩選得到17株菌落形態(tài)不同的內(nèi)生真菌；通過對峙培養(yǎng)，篩選得到的SS-17菌株對層出鐮刀菌﹑禾谷鐮刀菌﹑玉米大斑病菌﹑玉米小斑病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用；通過對SS-17菌株的形態(tài)特征觀察及ITS分子鑒定，鑒定該菌株為黑附球菌。

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