BMP2信號轉(zhuǎn)導通路在特發(fā)性高鈣尿大鼠腎結(jié)石形成中的調(diào)控作用

白栩搏

(冀中能源邢臺礦業(yè)集團總醫(yī)院泌尿外科，邢臺 054000)

腎結(jié)石是泌尿外科常見病之一，嚴重威脅人類健康[1]。目前對腎結(jié)石的發(fā)病機制仍不完全清楚。特發(fā)性高鈣尿(idiopathic hypercalciuria，IH)是臨床常見的代謝異常，也是草酸鈣結(jié)石的主要危險因素[2]。調(diào)查顯示[3]，成人IH發(fā)病率為5%～8%，而合并IH的人群尿結(jié)石發(fā)病率是正常人群的5倍。盡管已知IH是腎結(jié)石的高危因素，但其在腎結(jié)石形成中的作用及機制尚不清楚。國外最新研究顯示[4]，骨形成蛋白(bone morphoenetic protein，BMPs)與成骨分化和骨質(zhì)形成有關，其中骨形成蛋白2(BMP2)信號通路參與調(diào)控的異位鈣化是多種結(jié)石的主要誘導因素。BMP2、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related protein 2，RUNX2)、肌肉片段同源盒2(muscle segment homeobox 2，MSX2)和鋅指結(jié)構轉(zhuǎn)錄因子(osterix，Osx)均是BMP2信號通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，且上述轉(zhuǎn)錄因子在血管鈣化部位呈高表達。因此，本研究利用高鈣尿模型大鼠，研究BMP2信號轉(zhuǎn)導通路在腎結(jié)石形成中的調(diào)控機制。

1 儀器與試藥

1.1儀器 凝膠成像分析系統(tǒng)(鄭州博邦公司)；DYY-10C電泳儀(北京六一儀器公司)；7500定量PCR儀(美國Thermo fisher公司)；RM2235石蠟切片機(德國徠卡儀器有限公司)。

1.2試藥 Von Kossa鈣染色試劑盒，購自上海舜田生物科技有限公司；兔抗大鼠BMP2抗體、兔抗大鼠MSX2抗體、兔抗大鼠RUNX2抗體和兔抗大鼠Osx抗體，均購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠二抗，購自武漢博士德生物工程公司；β-actin購自上海北諾生物科技有限公司；RIPA裂解液，購自北京碧云天生物技術有限公司；RNA提取試劑Trizol，購自美國Invitrogen公司；實時定量PCR反應液SYBR Green Ⅰ premix，購自日本TaKaRa公司；cDNA第一鏈合成試劑盒，購自Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1大鼠分組 20只清潔級遺傳性高鈣尿結(jié)石大鼠(GHS組)和20只體質(zhì)量、月齡配對的健康清潔級SD大鼠(對照組)，均購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，大鼠3月齡，體質(zhì)量200±20 g。大鼠于12 h光照/12 h黑暗條件下飼養(yǎng)，適用性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本研究取得實驗動物倫理委員會批準，嚴格按照科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》[5]的相關要求進行操作。

2.2樣本采集 2組大鼠適用性喂養(yǎng)1周后，腹腔注射質(zhì)量濃度為20 g·L-1的戊巴比妥鈉3 mL·kg-1全身麻醉，無菌操作下將腹膜切開，完全切下腎臟組織，液氮中保存待用。

2.3Von Kossa鈣染色 從液氮中取出腎臟組織，用PBS緩沖液沖洗3次，用質(zhì)量濃度為0.4 g·L-1的多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度4 μm的連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟至水。加入質(zhì)量濃度為5 g·L-1的硝酸銀溶液1 mL，紫外光燈下照射1 h。雙蒸水沖洗3次，加入1 mL質(zhì)量濃度為50 g·L-1的硫代硫酸鈉溶液處理5 min，吸出殘液。自來水反復沖洗，加入2滴核固紅染液復染10 min，蒸餾水沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，室溫下晾干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot法)檢測BMP2、MSX2、RUNX2和Osx的蛋白表達 液氮中取出腎臟組織，用手術剪將腎臟組織剪成小塊，置于勻漿器中，加入1 mL RIPA裂解液，冰浴上提取總蛋白，BCA蛋白濃度試劑盒檢測總蛋白質(zhì)量分數(shù)。取50 μg總蛋白和等體積的上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入質(zhì)量濃度為5 g·L-1的脫脂牛奶孵育封閉1.5 h。用封閉液稀釋相應的一抗：BMP2(1∶500)、MSX2(1∶200)、RUNX2(1∶200)和Osx(1∶300)，將PVDF膜浸于一抗的稀釋液中，4 ℃孵育過夜。用PBS緩沖液沖洗PVDF膜3次，再加入HRP標記的二抗(1∶20 000稀釋)，室溫振蕩2 h。ECL化學發(fā)光顯影試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參照，掃描目的條帶和內(nèi)參條帶，使用Image J軟件對條帶進行分析，計算目的條帶的相對表達量。

2.5實時定量PCR(RT-PCR)檢測BMP2、MSX2、RUNX2和Osx mRNA表達 取50 mg腎臟組織，液氮中用研缽將組織充分研成粉末，置于勻漿器中，加入1 mL Trizol提取試劑冰浴上孵育5 min，4 ℃下以5 000 r·min-1離心5 min，抽取上清液，加入150 μL氯仿充分振蕩孵育5 min，同樣條件下離心10 min，取上層液。加入400 μL異丙醇冰浴振蕩5 min，4 ℃下以5 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液；沉淀用體積分數(shù)為70%的乙醇洗滌3次，紫外分光光度計檢測260和280 nm處吸光度的比值，確定總RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄反應試劑盒說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。采用Primer Premeir 5.0軟件設計引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見表1。PCR反應體系：上下游引物各0.2 μL，SYBR Green Ⅰ premix 12 μL，雙蒸水5.6 μL，cDNA 2 μL，總反應體系20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性15 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，總計40個循環(huán)。反應結(jié)束后直接讀取Ct值，以β-actin作為內(nèi)參，按照2-△△Ct值計算目的基因相對表達量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)-(Ct對照基因-Ct β-actin)。

表1引物序列

Tab.1 The primer sequence

引物名稱引物序列BMP2引物上游:5'-GGCTGAGGGTTAGTGAGCA-3'序列下游:5'-AGGGAGTTGGTGAAAGACATC-3'MSX2引物上游:5'-AGGGCAGAATCATGAGCAAGT-3'序列下游:5'-AGGGTCTGCATTGGATGGCA-3'RUNX2引物上游:5'-CAGGCATTTCATCCCTCACT-3'序列下游:5'-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3'Osx引物上游:5'-CCAAGGCAGTTGGCAATAGT-3'序列下游:5'-ATGAATGGGCTTCTTCCTCA-3'β-actin引物上游:5'-CACCATTGGCAATGAGGGGTTC-3'序列下游:5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'

3 結(jié)果

3.1腎臟組織Von Kossa鈣染色結(jié)果 利用Von Kossa染色法檢測2組大鼠鈣鹽沉積情況，見圖1。由圖1可知，GHS組大鼠腎間質(zhì)中有明顯的鈣鹽沉積(鈣鹽被硝酸銀染成黑色)；而對照組大鼠腎間質(zhì)則未見鈣鹽沉積情況。

圖1大鼠腎間質(zhì)VonKossa鈣染色結(jié)果(×200)

A.對照組；B.GHS組。注：箭頭表示鈣鹽沉積。

Fig.1 The Von Kossa calcium staining in rat renal interstitium (×200)

A.control group；B.GHS group.Note:the arraw indicates calcium deposition.

3.2腎臟組織BMP2、MSX2、RUNX2和Osx mRNA表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，GHS大鼠BMP2、MSX2、RUNX2和Osx mRNA表達水平明顯高于對照組，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2RT-PCR檢測BMP2、MSX2、RUNX2和OsxmRNA在大鼠腎臟組織中的表達

A.BMP2 mRNA表達；B.MSX2 mRNA表達；C.RUNX2 mRNA表達；D.Osx mRNA表達。*P<0.05，**P<0.01：GHS組vs對照組。

Fig.2 The expression of BMP2，MSX2，RUNX2 and Osx mRNA in rat renal tissues detected by RT-PCR

A.the expression of BMP2 mRNA；B.the expression of MSX2 mRNA；C.the expression of RUNX2 mRNA；D.the expression of Osx mRNA.*P<0.05，**P<0.01：GHS group vs control group.

3.3腎臟組織BMP2、MSX2、RUNX2和Osx蛋白表達 與RT-PCR結(jié)果一致，Western Blot檢測結(jié)果顯示，GHS大鼠腎臟組織BMP2、MSX2、RUNX2和Osx蛋白明顯高于對照組，2組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3WesternBlot檢測BMP2、MSX2、RUNX2和Osx蛋白在大鼠腎臟組織中的表達

A.BMP2蛋白表達；B.MSX2蛋白表達；C.RUNX2蛋白表達；D.Osx蛋白表達。**P<0.05，**P<0.01：GHS組vs對照組。

Fig.3 The expression of BMP2，MSX2，RUNX2 and Osx protein in rat renal tissues detected by Western Blot

A.the expression of BMP2 protein；B.the expression of MSX2 protein；C.the expression of RUNX2 protein；D.the expression of Osx protein.*P<0.05，**P<0.01：GHS group vs control group.

4 討論

泌尿結(jié)石是最常見的泌尿系統(tǒng)疾病，多數(shù)患者發(fā)病年齡為30～45歲，且發(fā)病呈年輕化趨勢[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，40%以上的腎結(jié)石患者尿鈣明顯升高，這種升高機制可能與消化道鈣吸收增加、腎臟重吸收受限以及骨重吸收有關。張彬等[8]報道證實，IH是泌尿結(jié)石的危險因素之一，具有明顯的遺傳特點。IH與遺傳性高鈣尿(GHS)具有相似的生理病理特征，即血清鈣在正常范圍內(nèi)，但腎小管對鈣重吸收減弱導致尿鈣增加，進而自發(fā)形成結(jié)石，且這種結(jié)石的形成僅與遺傳有關[9]。因此，GHS被認為是研究IH理想的動物模型。近年來研究報道[10]，IH大鼠腎間質(zhì)存在明顯鈣化現(xiàn)象，特別是已形成腎結(jié)石者，腎間質(zhì)鈣化尤為明顯。本研究利用Von Kossa鈣染色法檢測大鼠腎組織的鈣鹽沉積情況，結(jié)果顯示，GHS組大鼠腎間質(zhì)中存在明顯的鈣鹽沉積，而對照組大鼠腎間質(zhì)無鈣鹽沉積現(xiàn)象。這一結(jié)果提示，GHS可能在某種調(diào)控作用下形成結(jié)石。然而關于高鈣尿?qū)δI結(jié)石形成的調(diào)控機制尚不清楚。

國外最新研究表明[11]，結(jié)石形成的誘因：異位鈣化與骨礦化過程具有相似的調(diào)控過程。BMPs屬于TGF-β超家族成員之一，也是參與骨合成的重要代謝因子。BMPs與特異性受體結(jié)合后，通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導機體發(fā)生異位鈣化。BMP2與異位鈣化的關系最為密切，機體在一系列外界刺激下，誘導間充質(zhì)前體細胞分泌BMP2，并激活BMP2介導的信號通路調(diào)控前體細胞分化為成骨樣細胞，并促進基質(zhì)礦化[12]。BMP2信號通路包括BMP2、MSX2、RUNX2和Osx轉(zhuǎn)錄因子，也是骨骼形成的重要調(diào)控因子。Kee H J等[13]報道，BMP2通過Smad信號通路誘導MSX2和RUNX2表達上調(diào)，其中RUNX2是Osx的上游調(diào)控基因，參與骨細胞的形成、分化。劉光源等[14]則證實，MSX2高表達能夠上調(diào)間充質(zhì)細胞Osx表達，且這種高表達特異性貫穿于整個骨形成過程。Osx是含有特殊鋅指結(jié)構的轉(zhuǎn)錄因子，也被證實參與調(diào)控成骨分化和骨形成。Shrivats A R等[15]利用siRNA技術沉默小鼠Osx基因表達，結(jié)果顯示，干擾組小鼠軟骨發(fā)育出現(xiàn)明顯異常，表現(xiàn)為軟骨骨化受阻。

本實驗利用GHS大鼠模型研究BMP2信號通路在腎結(jié)石形成中的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，BMP2、MSX2、RUNX2、Osx蛋白和mRNA表達均明顯高于對照組大鼠，提示GHS可能通過激活BMP2信號通路誘導腎結(jié)石的形成。田晶等[16]報道，GHS大鼠腎臟組織維生素D受體(VDR)和BMP2表達上調(diào)，并調(diào)節(jié)腎間質(zhì)鈣化。研究表明[17]，腎間質(zhì)異位鈣化向腎乳頭延伸，誘導尿鈣晶體聚集黏附，最終出現(xiàn)鈣鹽沉積而形成結(jié)石。Cao H等[18]報道,VDR是BMP2信號通路的激活誘因，在血管鈣化方面發(fā)揮關鍵作用。本研究限于篇幅，尚未檢測2組大鼠VDR表達水平，這也是未來研究的方向之一。

綜上所述，本研究初步證實了高鈣尿通過激活BMP2信號通路調(diào)控腎結(jié)石的形成，此結(jié)果為研究腎結(jié)石的發(fā)病機制指明了新方向。