許巍，劉必林、2、3，陳新軍、2、3,桓夢瑤

(1.上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306; 2.國家遠洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306; 3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306)

眼睛晶體是頭足類重要視覺器官，由前后兩個半球組成，其功能與脊椎動物的眼睛晶體相似[1]，主要用于輔助捕食和躲避敵害[2]，但是頭足類與脊椎動物眼睛晶體的生成原理和蛋白質(zhì)組差異明顯[3]。近年來，眼睛晶體越來越受到研究頭足類的學者關(guān)注，被認為是除耳石、角質(zhì)顎、內(nèi)殼之外，又一記錄頭足類生活史信息的硬組織材料[4-7]，盡管它在年齡和生長的研究上不如其他硬組織，但在微化學尤其個體發(fā)育期穩(wěn)定同位素的分析上比其他硬組織更有效、更可靠。為此，本研究中從眼睛晶體的尺寸、微結(jié)構(gòu)、微量元素和穩(wěn)定同位素等方面，回顧了其在頭足類年齡、生長、攝食、棲息和洄游等基礎(chǔ)生活史過程中的應(yīng)用，旨在為中國頭足類基礎(chǔ)生物與生態(tài)學研究提供參考。

1 晶體結(jié)構(gòu)與組成

眼睛晶狀體(以下簡稱晶體)是眼球中重要的屈光裝置[8]，前后兩面交界處為赤道部，兩面的頂點分別為晶狀體前極、后極。頭足類與脊椎動物類似，依靠晶狀體前后位置或曲度的變化，進行視覺的調(diào)節(jié)。晶狀體由晶狀體囊和晶狀體纖維組成。晶狀體囊為一透明薄膜，完整地包圍在晶狀體外面。前囊下有一層上皮細胞，當上皮細胞到達赤道部后，不斷伸長、彎曲，移向晶狀體內(nèi)，成為晶狀體纖維。晶狀體纖維在一生中不斷生長，并將舊的纖維擠向晶狀體的中心，并逐漸硬化而成為晶狀體核，晶狀體核外較新的纖維稱為晶狀體皮質(zhì)[9]。

2 晶體尺寸

海洋生物眼睛晶體的大小一方面反映晶體自身的生長，另一方面可反映生物個體本身的生長。眼睛晶體的大小(直徑和質(zhì)量)已被嘗試用于魚類的年齡和生長的研究[10-12]。而對頭足類眼睛晶體的相關(guān)研究開展較少，有學者認為，可通過建立眼睛晶體直徑與頭足類胴長的關(guān)系，或通過分析不同年齡頭足類個體的眼睛晶體折射率的變化來研究頭足類的生長[13]。Hall[14]分析認為，澳大利亞巨烏賊Sepiaapama眼睛晶體的直徑和濕質(zhì)量與雌、雄個體胴長均呈線性關(guān)系。Northern[15]分析認為，強壯桑椹烏賊Moroteuthisingen眼睛晶體的直徑和質(zhì)量與雌、雄個體胴長及雄性個體的體質(zhì)量呈線性關(guān)系，而與雌性個體的體質(zhì)量呈指數(shù)關(guān)系，這是因為雌性個體在性成熟后由于性腺的快速發(fā)育導致體質(zhì)量迅速增加，而此時眼睛晶體的生長則非常緩慢。

3 晶體微結(jié)構(gòu)

3.1 晶體切片制作與觀察

Baqueiro-Cárdenas等[5]詳細介紹了頭足類眼睛晶體切片的制作過程與觀察方法，Rodríguez-Domínguez等[6]在此基礎(chǔ)上進行了改進。切片的制作主要包括固定、脫鈣、脫水、沖洗、包埋等5個步驟：(1)固定，用中性福爾馬林或70%(體積分數(shù)，下同)酒精浸泡晶體72 h；(2)脫鈣，用流水沖洗72 h，用脫鈣溶液(15%檸檬酸鈉和50%甲酸混合溶液)浸泡24 h后，更換脫鈣溶液繼續(xù)浸泡24 h，再用流水沖洗24 h；(3)脫水，在95%酒精溶液中浸泡1.5 h，然后每0.5 h更換1次酒精溶液，連續(xù)更換3次后改用100%酒精浸泡，每0.5 h更換一次酒精，連續(xù)更換3次；(4)沖洗，用超純水浸泡0.5 h后更換超純水再浸泡1 h；(5)包埋，在石蠟溶液中浸泡1 h后，更換溶液繼續(xù)浸泡1 h，最后再用新鮮的石蠟溶液繼續(xù)浸泡2 h。

切片染色主要包括失蠟、水化、染色、脫水、沖洗等5個步驟：(1)失蠟，超純水中浸泡20 min，每10 min換一次超純水；(2)水化，先用100%酒精浸泡5 min，再用95%酒精浸泡5 min，最后用蒸餾水浸泡10 min；(3)染色，在蘇木精溶液中浸泡4 min，然后流水沖洗5 min，并先后在1%磷鉬酸溶液和蒸餾水中浸2～3 s，再在伊紅溶液中浸泡1 min，然后先后分別在蒸餾水、1%磷鉬酸溶液和蒸餾水中浸2～3 s；(4)脫水，在95%酒精中浸泡2 min，再在100%酒精中浸泡4 min，每2 min換一次酒精；(5)沖洗，在超純水中浸泡10 min，每5 min更換一次超純水。

為了方便晶體微結(jié)構(gòu)的觀察，將制作好的晶體切片置于載玻片上，用膠頭滴管滴上清水；在連接有CCD的顯微鏡下(400×)對生長紋進行拍照，用圖像處理軟件對所拍圖片進行拼圖處理。值得注意的是，在對晶體進行連續(xù)拍照時，盡量在相鄰的兩個視野中至少保持有一個特殊標記(圖1)，這樣可以確保后期圖片拼接的準確性[5]。

3.2 晶體微結(jié)構(gòu)在年齡與生長中的應(yīng)用

頭足類眼睛晶體是除耳石、角質(zhì)顎和內(nèi)殼以外的少數(shù)硬組織之一，它由許多同心的纖維層組成[16]。Willekens等[17]和Clarke[18]先后在幾種頭足類的眼睛晶體中發(fā)現(xiàn)這種同心生長紋結(jié)構(gòu)，然而其形成的周期性主要存在三種不同觀點：第一種觀點認為，晶體生長紋與頭足類實際日齡相符[5,19]，根據(jù)此假設(shè)，Agus等[20]估算地中海撒丁島海域的槍烏賊Loligovulgaris和福氏槍烏賊Loligoforbesii的壽命分別為17、18個月；第二種觀點認為，晶體生長紋與頭足類實際日齡無關(guān)[14,21]，持這種觀點的學者發(fā)現(xiàn)，在某些頭足類當中，其晶體生長紋遠遠超過實際日齡；第三種觀點認為，晶體生長紋的形成雖然具有周期性，但不是每日一紋，其沉積規(guī)律可能依種類和生活環(huán)境的不同而變化[6]。

圖1 紅色腸腕蛸眼睛體圖片的拼接示意圖[5]Fig.1 Identifying marks in individual images to integrate a mosaic of eye lens in crystalline structure of octopus Enteroctopus megalocyathus [5]

4 晶體微量元素在棲息環(huán)境中的應(yīng)用

海洋生物的眼睛晶體與耳石、骨骼、鱗片等其他硬組織不同，它的鈣化程度為零，不太適合用作微量元素分析[22]。盡管如此，研究者們還是在魚類眼睛晶體中探測到了Ba、Co、 Cu、Fe、Hg、Mn、Pb、Rb和Sr等微量元素[23]，它們與魚類耳石、鱗片和鰭條中的微量元素種類組成和含量不同[24-26]。Dove等[25]認為，晶體中微量元素的富集與空間環(huán)境變化有關(guān)，Kingsford等[27]認為，其與水深也存在關(guān)系。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)，作為魚類耳石中不容易檢出的Hg和Pb元素，在眼睛晶體中則易被檢出，這可以作為魚類耳石微量元素研究的一個有力補充[25,27]。Gillanders[26]研究認為，眼睛晶體微量元素可用作魚類的種群判定。然而，至今未見到關(guān)于頭足類眼睛晶體微量元素的研究報道。

5 晶體碳氮穩(wěn)定同位素

5.1 晶體斷面取樣方法

眼睛晶體蛋白質(zhì)含量可達50%[28]，故其比耳石更適合碳(δ13C)氮(δ15N)穩(wěn)定同位素的分析[29]。一般認為，通過對眼睛晶體不同時間斷面碳氮穩(wěn)定同位素的分析，可以獲取頭足類不同生活史階段的攝食生態(tài)信息，具體試驗方法如下：(1)分離，取出晶體，移除晶體的遠端，保留晶體的近端；(2)浸泡，用蒸餾水浸泡近端晶體5 min，使其充分吸水；(3)測量，用游標卡尺測量浸泡處理過的近端晶體的直徑；(4)微取樣，在解剖鏡下，用無水酒精消毒過的寬頭鑷子，由晶體最外層向晶體核心剝?nèi)?.5 mm左右厚的晶體；(5)再測量，用游標卡尺測量剝?nèi)【w后剩余晶體的直徑；(6)重復以上步驟(4)和(5)的過程，直至晶體核心部分直徑約為0.5 mm，依據(jù)晶體大小的不同可獲得若干個不同斷面的晶體樣品。

圖2 眼睛晶體取樣示意圖Fig.2 Schematic diagram of subsampling in eye lens

5.2 晶體碳氮穩(wěn)定同位素在攝食生態(tài)分析中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的穩(wěn)定同位素法主要采用肌肉分析頭足類的攝食生態(tài)[30-32]，由于肌肉自身新陳代謝的存在，它往往只能反映取樣前兩個月內(nèi)的攝食信息[33]。與魚類的眼睛晶體相似，頭足類的眼睛晶體缺少蛋白質(zhì)的合成和分解，因而幾乎不存在新陳代謝作用，即未有蛋白質(zhì)的更新[16]。因此，眼睛晶體各斷面層所包含的穩(wěn)定同位素信息反映了其形成時的攝食信息，通過對眼睛晶體不同斷面穩(wěn)定同位素的分析，可重建頭足類個體發(fā)育期的攝食生態(tài)史。Parry[34]分析了14尾柔魚Ommastrephesbartramii和15尾鳶烏賊Sthenoteuthisoualaniensis的眼睛晶體不同斷面的δ15N，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著個體發(fā)育過程中胴長的增加，δ15N不斷增加，這說明柔魚和鳶烏賊捕食餌料的營養(yǎng)級隨著個體發(fā)育不斷上升。Hunsicker[35]和Hunsikcer等[4]利用眼睛晶體的碳氮穩(wěn)定同位素分析了貝烏賊Berryteuthismagister不同生長階段的攝食變化,以及在東白令海所處的生態(tài)地位。研究結(jié)果顯示，貝烏賊幼體到成體期營養(yǎng)級上升1級，貝烏賊的食譜不是由餌料大小所決定，而是與該區(qū)域其他商業(yè)性捕撈魚類享有共同的食譜范圍。

5.3 晶體碳氮穩(wěn)定同位素在棲息洄游分析中的應(yīng)用

近年來，基于角質(zhì)顎和內(nèi)殼碳氮穩(wěn)定同位素信息被廣泛用于頭足類的棲息環(huán)境與洄游路線重建[33,36-41]。然而，關(guān)于眼睛晶體的相關(guān)研究目前僅有一篇報道[7]，該研究通過眼睛晶體的碳氮穩(wěn)定同位素分析了莖柔魚的起源及其洄游史策略，具體根據(jù)眼睛晶體δ13C和δ15N個體間的較大差異推斷莖柔魚的洄游路線比較復雜，并根據(jù)眼睛晶體核心層較低的δ13C推斷莖柔魚出生地在37°N以北。

6 展望

由于眼睛晶體生長紋形成周期的不確定性，致使通過眼睛晶體微結(jié)構(gòu)直接研究頭足類年齡和生長受到了一定程度的限制，盡管如此，隨著基于眼睛晶體放射性同位素碳的年齡鑒定技術(shù)在魚類中的應(yīng)用[42]，在頭足類中的相關(guān)研究也值得期待。近年來，隨著分析手段不斷提升，頭足類硬組織的微化學尤其碳氮穩(wěn)定同位素的分析被廣泛用于頭足類基礎(chǔ)生態(tài)學研究。盡管角質(zhì)顎穩(wěn)定同位素均有一些報道[43-44]，但是新生的角質(zhì)顎無法與舊生的角質(zhì)顎分開，故無法從時間序列上分析頭足類的穩(wěn)定同位素。此外，角質(zhì)顎中存在的大量蛋白質(zhì)、角質(zhì)和色素也會影響同位素的測定結(jié)果[45]。內(nèi)殼的生長不僅是長度的生長，而且其寬度也在生長[46]，因此，從嚴格意義上來說，沿長度方向的截面不能完全反映頭足類不同生長階段的生態(tài)學信息[38-39]。頭足類耳石主要成分為碳酸鹽(95%)，其蛋白質(zhì)含量較低[47-48]，且體積太小，因此，不適合用于碳氮穩(wěn)定同位素的分析，但適合用作微量元素分析[49-51]。頭足類眼睛晶體與以上這幾種硬組織相比，在穩(wěn)定同位素的測定上有著明顯的優(yōu)勢。首先，眼睛晶體體積較大(直徑為10～20 mm)，能夠滿足穩(wěn)定同位素的測定；其次，眼睛晶體是一層一層的包裹式生長，很容易剝落，因此，可以從時間序列上準確的分析頭足類的生活史信息。今后的研究中需要對比頭足類耳石年齡，準確掌握眼睛晶體各層斷面形成的確切時間，進而重建頭足類的棲息、洄游和攝食等生活史信息。