王曉朋 吳秀娟 趙宗峰 王 鵬 布瓦杰爾·亞克亞 普雄明 康曉靜

白癜風(fēng)是一種難治性色素脫失性自身免疫性皮膚病，是皮膚黏膜內(nèi)黑素細(xì)胞選擇性毀損所致。本病在世界范圍內(nèi)發(fā)病率為0.5%～2%[1]，我國人群中發(fā)病率約0.5%[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)啟動(dòng)區(qū)基因單核苷酸多態(tài)性與白癜風(fēng)疾病易感性相關(guān)[3-5]，且不同人群中TNF-α啟動(dòng)區(qū)多態(tài)性可能存在不同[6]。本研究為進(jìn)一步探討白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中TNF-α基因啟動(dòng)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與中國維吾爾族人群白癜風(fēng)相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2011-2014年新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科維吾爾族白癜風(fēng)患者316例，年齡(23.90±14.67)歲，男∶女為4∶5；維吾爾族健康對(duì)照組330例，年齡(25.25±11.18)歲，男∶女為3∶2。根據(jù)以下特點(diǎn)將白癜風(fēng)患者分組：發(fā)病年齡(早發(fā)型：發(fā)病年齡≤20歲和遲發(fā)型：>20歲)；白癜風(fēng)分型(局限型、散發(fā)型、泛發(fā)型、肢端型)；白癜風(fēng)家族史(有和無)。經(jīng)知情同意并簽字后抽取外周靜脈5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ邪遵帮L(fēng)患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)頒布的關(guān)于白癜風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)和疾病分期(2010年)[7]由兩位皮膚科醫(yī)生進(jìn)行診斷，并排除其他可能導(dǎo)致色素減退的疾病如花斑癬、貧血痣、斑駁病、白化病、單純糠疹、老年性白斑等。健康對(duì)照組排除自身免疫性和系統(tǒng)性疾病的白癜風(fēng)人群，同時(shí)要求均無白癜風(fēng)家族史。本研究通過新疆自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和基因型DNA提取 用2.5%EDTA抗凝管取肘靜脈血1 mL。利用全血基因DNA提取試劑盒(TIANamp 北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成)提取白癜風(fēng)患者及健康對(duì)照組DNA。所得樣本-80℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 用在線軟件primer3 input 設(shè)計(jì)合適長度488 bp且包含三個(gè)目的位點(diǎn)SNP的擴(kuò)增引物(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，上游引物：5’-TCGATGAAGCCCAATAAACC-3’，下游引物：5’-TTTCATTCTGACCCGGAGAC-3’。PCR反應(yīng)體系：總體積25 μL，包含1 μL引物混合液，2×Tap PCR Green Mix 12.5 μL，2 μL模板，9.5 μL去離子水。取5 μL PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段長度，所有PCR產(chǎn)物均合格。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，60℃退火45 s，72℃ 延伸30 s，72℃再延伸 5 min，35個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。

1.3 基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè) 應(yīng)用DNA測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)。普通PCR擴(kuò)增目的基因片段產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工公司測(cè)序，測(cè)序儀器為美國ABI3730型DNA 全自動(dòng)測(cè)序儀完成測(cè)序并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SSPS 17.0軟件包進(jìn)行分析。白癜風(fēng)組和健康對(duì)照組定量資料計(jì)算用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律進(jìn)行檢測(cè)?？ǚ綑z驗(yàn)(χ2)比較不同組別等位基因頻率及基因型頻率，相對(duì)危險(xiǎn)度用比值比(OR)以及95%可信區(qū)間(95%CI)來評(píng)價(jià)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α SNP的基因型及等位基因在兩組的分布 各組TNF-α基因三種位點(diǎn)九種基因型及等位基因在維吾爾族白癜風(fēng)患者和正常對(duì)照組的分布，見表1。維吾爾族白癜風(fēng)和對(duì)照組TNF-α rs1799964、TNF-α rs1800630、TNF-α rs1799724-基因型和等位基因比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 TNF-α SNP在白癜風(fēng)組臨床表型的分布 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724的基因型、等位基因在維吾爾族白癜風(fēng)患者臨床表型(性別、年齡、分型、家族史)進(jìn)行分層比較所得χ2值、P值、OR(95%可信區(qū)間)分布，見表2、表3。白癜風(fēng)患者TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型和等位基因頻率在性別均無明顯差異(P>0.05)。TNF-α rs1799724基因型頻率在早發(fā)型、局限型及有家族史的患者顯著高于遲發(fā)型其他三種類型(散發(fā)型、泛發(fā)型、肢端型)及無家族史的患者，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，TNF-α rs1799724等位基因頻率在有家族史的患者與無家族史的患者比較顯示有顯著差異(OR=4.269，95%CI:1.822～9.999)。

表1 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型及等位基因在兩組的分布

注：(G)代表基因型，(A)代表等位基因；rs1799964、rs1800630、rs1799724(基因型及等位基因頻率在維吾爾族白癜風(fēng)組與對(duì)照組比較，均P>0.05)

表2 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型與維吾爾族白癜風(fēng)臨床表型的分布

表3 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724等位基因與維吾爾族白癜風(fēng)臨床表型的分布

3 討論

細(xì)胞因子是一種重要的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的不平衡甚至缺陷會(huì)引起免疫功能的不同反應(yīng)，因此，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)可能很大程度上決定了自身免疫疾病的易感性與嚴(yán)重性。TNF-α是一種多功能的重要細(xì)胞因子，表達(dá)于巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，在預(yù)防感染、檢測(cè)腫瘤和炎癥的刺激反應(yīng)中起廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。表皮黑素細(xì)胞單元由黑素細(xì)胞和32個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞組成。TNF-α[8]作為角質(zhì)形成細(xì)胞旁分泌細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞表面ICAM-1和IFN-r的表達(dá)和啟動(dòng)細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致黑素細(xì)胞死亡，顯著抑制黑素細(xì)胞增殖及降低酪氨酸酶活性，但具體通過什么通路和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。相關(guān)研究顯示，TNF-α在尋常型白癜風(fēng)患者血清、皮損水平顯著高于健康人群，且進(jìn)展期呈現(xiàn)最高值。同時(shí)，TNF-α[9]拮抗劑通過抑制黑素細(xì)胞特異細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)黑素細(xì)胞的破壞進(jìn)而阻止進(jìn)展期白癜風(fēng)患者色素進(jìn)一步脫失，故TNF-α在白癜風(fēng)發(fā)病過程中扮演重要角色。

TNF基因位點(diǎn)位于人類6號(hào)染色體上21區(qū)3帶6p(6p21.31)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)III類區(qū)域內(nèi)，長約3Kb，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。在TNF基因5’末端調(diào)控序列在轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄水平上監(jiān)管TNF-α的生成，并且TNF-α基因多態(tài)性在不同種族中存在差異[10-12]，而這些差異可能導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)病、進(jìn)展及預(yù)后在不同民族存在差異[13,14]。目前研究最多的五個(gè)位點(diǎn)：rs361525G/A、rs1800629A/G、rs1799724C/T、rs1800630C/A和rs1799964T/C。TNF-α啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性與糖尿病、甲狀腺疾病、痤瘡、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病易感性相關(guān)，但國內(nèi)TNF-α rs1799724、rs1800630和rs1799964與白癜風(fēng)相關(guān)性的尚未見報(bào)道。2006年，對(duì)61個(gè)土耳其白癜風(fēng)的研究首次報(bào)道TNF-α rs1800629G/A與白癜風(fēng)患者易感性無明顯相關(guān)性[4]。而2009年，通過對(duì)176個(gè)伊朗白癜風(fēng)患者的研究認(rèn)為，TNF-α rs1800629G/A在女性白癜風(fēng)患者與對(duì)照組有差異性，在男性白癜風(fēng)患者與對(duì)照亞類之間無差異性[3]。Laddha等[5]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α啟動(dòng)區(qū)rs361525、rs1800629、rs1799724、rs1800630、rs1799964基因多態(tài)性的基因型和等位基因在泛發(fā)型或局限型白癜風(fēng)患者均處于高表達(dá)水平與健康對(duì)照相比，且rs361525、rs1800629、rs1799724、和rs1799964多態(tài)性可提高白癜風(fēng)患者血清中TNF-α的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，而rs1800630-863多態(tài)性相反，暗示TNF-α啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與白癜風(fēng)易感性相關(guān)。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)rs1799724、rs1800630、rs1799964基因多態(tài)性的分布在白癜風(fēng)患者和對(duì)照組之間無顯著差異；進(jìn)一步分析rs1799724、rs1800630、rs1799964位點(diǎn)等位基因分布與白癜風(fēng)患者臨床表現(xiàn)相關(guān)性表明，rs1799724等位基因T參與有家族史白癜風(fēng)的發(fā)病。

rs1799724位點(diǎn)可與核轉(zhuǎn)錄因子-kB結(jié)合，該位點(diǎn)堿基的替換可阻礙與p50-p50二聚體的結(jié)合，從而減弱核轉(zhuǎn)移因子-kB在增強(qiáng)TNF-α活性的作用[15]。TNF-α的rs1799964位點(diǎn)存在堿基T

本研究通過對(duì)TNF-α啟動(dòng)區(qū)rs1799724、rs1800630、rs1799964三個(gè)SNP進(jìn)行分型研究，證實(shí)TNF-α rs1799724 T等位基因與中國維吾爾族白癜風(fēng)的相關(guān)性，更進(jìn)一步提示TNF-α在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但本研究尚有一些不足之處，第一，本研究基于單個(gè)基因多態(tài)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，在龐大的基因網(wǎng)絡(luò)中相互非常廣泛和復(fù)雜，而基因多態(tài)性之間是否有交互作用尚未明確，那么這些遺傳變異與疾病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性是否會(huì)受到其它基因多態(tài)性的影響尚不能明確。第二，TNF-α啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性在白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，其與白癜風(fēng)的可能相關(guān)性及作用機(jī)制疾病仍待更深入研究。