張淑紅，張運峰，范永山

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山063000)

玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是由玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)所引起的以葉部產(chǎn)生大型病斑癥狀為主的玉米病害，其分布廣、危害重，是世界性的真菌病害[1-2]。玉米大斑病菌利用無性分生孢子傳播，以侵染性菌絲在玉米寄主組織內(nèi)擴展，并通過產(chǎn)生HT毒素(Helminthosporiumturcicumtoxin)抑制寄主的防御體系，從而引起病害癥狀[3-4]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)、附著胞產(chǎn)生、致病性和HT毒素活性都有重要的調(diào)控作用[5-8]。鞏校東等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌至少存在Hog1、Slt2、Fus3/Kss1和Ime2等4條MAPK途徑。谷守芹[11]利用候選基因法克隆了3個MAPK基因STK1、STK2和STK3，其中STK1基因?qū)儆贖og1-MAPK途徑，主要與滲透脅迫和應(yīng)激脅迫調(diào)節(jié)有關(guān)；STK2基因?qū)儆赟lt2-MAPK途徑，主要與病原菌的致病性和孢子發(fā)育有關(guān)；STK3基因?qū)儆贔us3/Kss1-MAPK途徑，主要與細胞壁合成有關(guān)。Li 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，STK1基因不僅調(diào)控玉米大斑病菌的滲透脅迫調(diào)節(jié)，而且與菌絲、分生孢子和附著胞發(fā)育、毒素合成及致病性都有關(guān)。因此，STK1基因是調(diào)控玉米大斑病菌生長、發(fā)育和致病性的重要MAPK基因。

王梅娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在1.0 mol/L NaCl高滲脅迫條件下玉米大斑病菌生長受到抑制，甘油濃度增加，同時STK1基因的表達量穩(wěn)定增加，從而明確甘油是玉米大斑病菌主要的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。谷守芹[11]和Li 等[12,14]的研究也證明，在NaCl、KCl、LiCl等鹽脅迫條件下STK1基因具有重要的滲透調(diào)節(jié)功能。植物病原真菌進化了多條信號應(yīng)答途徑來適應(yīng)環(huán)境中的滲透壓變化，其中高滲透性甘油促分裂原激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(HOG-MAPK)是植物病原真菌中最主要的滲透脅迫調(diào)節(jié)途徑。該途徑通過促進甘油積累、延緩細胞生長及調(diào)節(jié)其他生理條件抵抗?jié)B透脅迫刺激[15]。在稻瘟病菌(Magnaportlregrisea)、炭疽病菌(Colletotrichnnrlagenarinm)、稻平臍蠕孢菌(Bipolarisoryzae)、栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)、小麥殼針孢(Mycosphaerellagraminicola)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerca)等植物病原真菌中均發(fā)現(xiàn)MAPK途徑，并克隆了相應(yīng)的Hog-MAPK同源基因[16]。但是在植物病原真菌高滲脅迫研究中，主要研究的是鹽脅迫對生長、發(fā)育和致病性的影響，對山梨醇等有機分子的滲透脅迫研究卻鮮見報道。

本研究利用玉米大斑病菌STK1基因的敲除突變體(knockout mutants，KO)，比較該突變體與野生型菌株(WT)在山梨醇脅迫下菌落生長速度、菌絲形態(tài)及脂類物質(zhì)在菌絲細胞內(nèi)沉積情況等方面的差異，分析玉米大斑病菌在山梨醇高滲脅迫下的滲透調(diào)節(jié)機制，為進一步明確STK1基因?qū)τ衩状蟀卟【鷿B透脅迫調(diào)節(jié)的分子機理，以及STK1基因在玉米大斑病菌生長、發(fā)育和致病性等方面的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

玉米大斑病菌野生菌株(WT)01-23 及其STK1基因敲除突變體(KO)STM-35，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)谷守芹教授提供。

1.2 試驗材料和供試培養(yǎng)基

油紅O染液[17]：取油紅0.5 g，加異丙醇至100 mL，60 ℃水浴中加溫溶解30 min，配成油紅O 儲備液，置于棕色小磨沙口瓶保存。臨用前取0.6 mL油紅O加蒸餾水0.4 mL，混合靜置10 min后用0.45 μm濾膜過濾除菌。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，水1 000 mL。

DPA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂粉12 g，水1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)和活化 將試管內(nèi)保存的野生菌株 01-23 和突變體STM-35 分別接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗倒置培養(yǎng)6 d后，再次轉(zhuǎn)接到PDA平皿上，培養(yǎng)至菌落直徑達到5 cm左右。

1.3.2 適宜高滲脅迫分析培養(yǎng)基的篩選 將野生菌株01-23分別接種于PDA和DPA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗倒置培養(yǎng)6 d后，挑取菌絲于潔凈載玻片上，滴入適量PBS緩沖液，置于顯微鏡下觀察。

1.3.3 高滲脅迫處理 無菌條件下，用打孔器(直徑為7 mm)在01-23和STM-35菌落外緣打取菌盤，然后接種至3 種不同山梨醇濃度(1.0，1.5，2.0 mol/L)的DPA 培養(yǎng)基平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗培養(yǎng)，以在無山梨醇的DPA 培養(yǎng)基上生長的菌株為對照(CK)。

1.3.4 菌落、菌絲形態(tài)觀察及生長速率測定 將菌株在高滲固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d 后，觀察菌落形態(tài)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率，顯微觀察菌絲的形態(tài)特征及發(fā)育情況。

抑制率=(對照菌落直徑-高滲處理菌落直徑)/(對照菌落直徑)×100%。

1.3.5 脂類物質(zhì)沉積的形態(tài)學(xué)觀察 將2.0 mol/L山梨醇處理的WT和KO菌株利用油紅O染液進行脂肪染色、制片，并在顯微鏡下觀察脂類物質(zhì)沉積的形態(tài)學(xué)變化。染色參照陳侃等[17]的方法略作修改，具體步驟：取培養(yǎng)10 d的菌株，向培養(yǎng)皿中加入3 mL無菌水，輕輕刮取菌絲，用雙層擦鏡紙過濾，濾液經(jīng)12 000 r/min離心5 min后去掉上清，收集沉淀，用液氮反復(fù)凍融5次，轉(zhuǎn)入4%中性甲醛中固定12 h，取出用PBS漂洗后放入60%異丙醇中浸泡30 min，取出后加入50 μL油紅O染液，黑暗條件下染色24 h，置于60%異丙醇中脫色，顯微鏡下觀察染色情況并照相。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用IBM SPSS Statistics (version 19)軟件(SPSS Inc.)對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌高滲脅迫培養(yǎng)基的篩選

由于PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯浸提液中含有鹽離子，并且不同馬鈴薯品種及熬煮時間都可能對其浸提液中鹽離子濃度產(chǎn)生影響，從而干擾本試驗中高滲脅迫分析結(jié)果。而蛋白胨作為一種化學(xué)產(chǎn)品，不僅排除了生產(chǎn)工藝的干擾，而且蛋白胨中不含鹽離子或鹽離子非常少，不會影響本試驗中高滲脅迫分析結(jié)果，因此本研究采用蛋白胨代替馬鈴薯浸提液的DPA培養(yǎng)基進行高滲脅迫分析。通過比較WT菌株與KO菌株在PDA和DPA培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基上WT菌株與KO菌株生長菌絲形態(tài)有較明顯的區(qū)別，WT菌株的菌絲細胞內(nèi)有明顯顆粒狀內(nèi)容物出現(xiàn)，而KO菌株的菌絲細胞內(nèi)無明顯顆粒狀內(nèi)容物。在DPA培養(yǎng)基上，WT菌株與KO菌株的菌絲細胞內(nèi)均有明顯的顆粒狀物出現(xiàn)，2種菌株的菌絲狀態(tài)相似。因此，DPA培養(yǎng)基更適于分析STK1基因?qū)B透脅迫的調(diào)控作用。

2.2 山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落生長的影響

山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落生長速度的影響見圖1。

由圖1可以看出，在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株與WT菌株的菌落生長速度沒有顯著差異，但在1.5和2.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌落生長速度都顯著低于WT菌株，表明KO菌株對較高濃度山梨醇的滲透脅迫比WT菌株更敏感。

對WT菌株，未加山梨醇和山梨醇濃度為1.0 mol/L 的DPA培養(yǎng)基中，WT菌株的菌落生長速度基本上一致；當(dāng)山梨醇濃度大于1.0 mol/L時，濃度越大，菌落生長速度越慢(圖1-A)，即高濃度山梨醇對WT菌株菌落生長速度有顯著抑制作用。

對KO菌株，在1.0 mol/L山梨醇高滲脅迫條件下，KO菌株的生長速度顯著加快，當(dāng)山梨醇濃度增加到1.5和2.0 mol/L時，菌落生長速度又顯著減慢，說明一定濃度山梨醇高滲脅迫對KO菌株的菌落生長速度有促進作用，但高濃度山梨醇卻有抑制作用(圖1-A)。

由圖1-B可以看出，除在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下KO菌株的菌落生長速度得到顯著的促進作用以外，其它處理的菌落生長速度均受到顯著的抑制作用。在1.5和2.0 mol/L山梨醇滲透脅迫下，KO菌株菌落生長速度的抑制率顯著高于WT菌株。

2.3 山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落形態(tài)和顏色的影響

在山梨醇高滲脅迫條件下，WT菌株和KO菌株的菌落形態(tài)沒有顯著變化，但菌落顏色變化非常明顯。在山梨醇高滲脅迫條件下，WT菌株的菌落顏色由黑色變?yōu)榛野咨?，而KO菌株則在1.5 mol/L山梨醇脅迫條件下菌落顏色變深，在1.0和2.0 mol/L山梨醇脅迫條件下菌落顏色變淺(圖2)。

圖2 山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落形態(tài)和顏色的影響Fig.2 Effects of sorbitol hypertonic stress on colony morphology and color of Setosphaeria turcica

2.4 山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響

山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，在無山梨醇添加的DPA培養(yǎng)基上，WT菌株和KO菌株的菌絲形態(tài)無明顯差別。在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌絲形態(tài)沒有明顯變化，而WT菌株的菌絲細胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的小型顆粒狀物質(zhì)。在1.5 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌絲細胞內(nèi)也出現(xiàn)了大量的小型顆粒狀物質(zhì)，而WT菌株的菌絲細胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的大型顆粒狀物質(zhì)。在2.0 mol/L 山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌絲變粗，原生質(zhì)體濃縮成顆粒狀，而WT菌株的菌絲細胞內(nèi)出現(xiàn)很多空隙。

2.5 山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲細胞內(nèi)脂類物質(zhì)沉積的影響

由于脂類物質(zhì)是玉米大斑病菌菌絲內(nèi)主要的滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)[13]，在圖3中出現(xiàn)的顆粒狀物質(zhì)極有可能是脂類物質(zhì)的積累。因此，本研究利用油紅O染色劑，對WT菌株和KO菌株在2.0 mol/L山梨醇高滲脅迫條件下菌絲細胞內(nèi)脂類物質(zhì)的沉積情況進行顯微觀察，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，與高滲脅迫處理前相比，2.0 mol/L山梨醇高滲脅迫后，WT菌株菌絲細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量明顯增多，并且脂滴體積明顯增加，而KO菌株的菌絲細胞變粗膨大，脂滴數(shù)量有所減少，但脂滴體積顯著變大。脂滴的分布情況也明顯不同，在高滲脅迫處理前，WT菌株和KO菌株的脂滴分布都不均勻，但山梨醇高滲脅迫處理后，WT菌株的脂滴大小及分布都比較均勻一致，而KO菌株大脂滴和小脂滴并存且分布極不均勻，位于中部或偏于某一側(cè)。該試驗結(jié)果與圖3的表現(xiàn)基本一致。

圖3 山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.3 Effects of sorbitol hypertonic stress on hypha morphology of Setosphaeria turcica

圖4 山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲細胞內(nèi)脂類物質(zhì)沉積的影響Fig.4 Effects of sorbitol hypertonic stress on lipid deposition in hypha cells of Setosphaeria turcica

3 討論與結(jié)論

山梨醇是一種重要的滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)，它可以與水、甘油和丙二醇混溶，因此具有與NaCl、KCl等鹽分子不同的化學(xué)性質(zhì)[18]。在植物的耐鹽脅迫研究中，200 μg/mL 山梨醇浸種處理可促進無花果種子萌發(fā)，加速可溶性糖和脯氨酸積累，增強無花果幼苗滲透調(diào)節(jié)，有效降低鹽脅迫對幼苗細胞造成的傷害，提高無花果幼苗耐鹽性[19]。因此，山梨醇滲透脅迫與鹽脅迫具有不同的滲透調(diào)節(jié)機制。在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，在相同的鹽離子濃度條件下，與野生型(WT)菌株相比，STK1基因敲除突變體(KO)菌株的菌絲生長緩慢，細胞內(nèi)容物減少，生理狀況降低[12,14]。但是本試驗的研究結(jié)果表明，在1.0 mol/L山梨醇滲透脅迫條件下，玉米大斑病菌KO菌株生長狀況與WT菌株沒有顯著差異，只有當(dāng)山梨醇濃度提高到1.5 mol/L以上時，才顯著抑制了KO菌株的菌絲生長速度。因此，STK1基因在山梨醇高滲脅迫調(diào)節(jié)過程中存在一個滯后的信號應(yīng)答過程。另外，與非滲透脅迫相比，在1.0 mol/L山梨醇滲透脅迫條件下，KO菌株菌絲生長速度不但未受到抑制，反而得到促進，說明1.0 mol/L山梨醇處理使玉米大斑病菌菌絲恢復(fù)了部分滲透脅迫調(diào)節(jié)功能，即1.0 mol/L山梨醇處理可能增強了菌絲的滲透脅迫調(diào)節(jié)能力，“補償”了STK1被敲除后造成的某些功能障礙。該試驗結(jié)果與山梨醇是桃[20]、煙草[21]等植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和醫(yī)藥領(lǐng)域滲透劑[22]的結(jié)論是一致的，并且Stavniichuk等[23]研究表明，山梨醇通路與MAPK通路可協(xié)同調(diào)控糖尿病的發(fā)生。但是，更高濃度的山梨醇對這一未知途徑也產(chǎn)生了一定的阻遏作用，使玉米大斑病菌的滲透脅迫調(diào)節(jié)能力受到了不可逆的抑制作用，不僅菌落生長速度受到抑制，而且細胞壁色素的合成受到干擾，菌絲顏色變淺；細胞內(nèi)物質(zhì)的降解能力下降，出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)積累。研究表明，參與滲透脅迫調(diào)節(jié)的細胞壁色素物質(zhì)為黑色素，而這些顆粒狀物質(zhì)極有可能是滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)[24-25]。王梅娟等[13]研究表明，玉米大斑病菌的滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)主要為甘油，而真菌細胞內(nèi)甘油主要來自于脂肪的降解。因此，菌絲細胞內(nèi)脂類物質(zhì)沉積形成的脂滴大小和分布與滲透脅迫調(diào)節(jié)能力密切相關(guān)。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，山梨醇高滲脅迫條件下，脂類物質(zhì)的沉積與顆粒狀物質(zhì)的分布基本一致。利用油紅O染色觀察脂類物質(zhì)在菌絲內(nèi)的沉積情況，發(fā)現(xiàn)STK1基因缺失后脂滴的大小及分布均與野生型菌株不同，因此，STK1基因很可能通過調(diào)控脂類物質(zhì)合成進行滲透脅迫調(diào)節(jié)。