梁奔夢，狄 冉，劉秋月，王翔宇，張效生，張金龍，胡文萍*，儲明星*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

我國絕大多數(shù)綿羊均表現(xiàn)出季節(jié)性發(fā)情的特點(diǎn)，但也有一些品種如小尾寒羊和湖羊?qū)儆诔Ｄ臧l(fā)情。發(fā)情調(diào)控受卵泡發(fā)育和激素分泌等多種因素的影響，而FMR1基因可能是影響綿羊發(fā)情調(diào)控的因素之一。Verkerk等[1]在人上研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因是一個高度保守的基因。人FMR1基因位于染色體Xq27.3，cDNA全長4 661 bp，有17個外顯子和16個內(nèi)含子組成，長38 kb[2]。FMR1基因在很多組織中都有表達(dá)，如大腦、小腦等腦部組織以及上皮組織[3]。FMR1基因及其翻譯的蛋白FMRP在人卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)[4]，該細(xì)胞在卵泡的生長和發(fā)育及卵母細(xì)胞的成熟過程中具有不可替代的作用。FMR1基因突變會影響小鼠的卵泡數(shù)量，使卵泡凋亡增加，該基因還可以調(diào)節(jié)大鼠的卵泡生長[5-7]。此外，在卵泡發(fā)育過程中，F(xiàn)MR1基因?qū)Υ萍に氐姆置谝约芭怕亚癓H峰的形成有一定的作用[8-9]。因此，推測FMR1基因可能參與哺乳動物的發(fā)情調(diào)控。目前關(guān)于該基因與發(fā)情調(diào)控相關(guān)的研究主要集中在大鼠[7]、小鼠[10-11]和人[12]上，而在綿羊中相關(guān)的研究鮮有報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)選取常年發(fā)情和多羔的小尾寒羊?yàn)檠芯繉ο螅謩e采集卵泡期和黃體期的組織，通過半定量RT-PCR對FMR1基因在卵泡期小尾寒羊18個組織中的表達(dá)情況以及采用熒光定量PCR對該基因在卵泡期和黃體期小尾寒羊5個繁殖組織間的表達(dá)差異進(jìn)行分析，初步探討FMR1基因與綿羊發(fā)情調(diào)控的關(guān)系，為研究綿羊繁殖調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和采樣要求

選擇健康狀況良好的卵泡期和黃體期成年小尾寒羊母羊各3只，年齡2～3歲。小尾寒羊來自天津農(nóng)科院畜牧所種羊場。采集下丘腦、垂體、大腦、小腦、甲狀腺、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、大腸、小腸、卵巢(左、右)、輸卵管、子宮體、子宮角18種組織。樣品采集要在屠宰后半小時之內(nèi)完成。采集的新鮮組織裝入2 mL RNase-Free凍存管，立即置于液氮中儲存，待所有樣品采集完成后轉(zhuǎn)入干冰運(yùn)輸，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司(北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)和熒光定量染料(SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ)均購于TaKaRa公司(大連)，TaqPCR Master Mix購于拓英坊科技有限公司(北京)。

1.3 組織總RNA的提取和檢測

使用動物組織總RNA提取試劑盒加Trizol(Invitrogen, 美國)提取各組織總RNA，用Nanodrop2000檢測提取RNA的濃度和OD值，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的綿羊FMR1基因mRNA序列(登錄號為：XM_015105001)，利用Primer 3.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以β-actin(NM_001009784)作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物名稱和序列、退火溫度以及擴(kuò)增片段大小見表1。

1.5 cDNA合成

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL：PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，5×PrimeScript Buffer(for Real Time) 4 μL，1 μg總RNA，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足20 μL。輕輕混勻后于PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA第一鏈。全程操作在冰上進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋，用持家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測，將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA置于-20 ℃保存，以用于檢測目的基因的表達(dá)。

表1 綿羊FMR1基因的引物信息Table 1 Primer information of FMR1 gene in sheep

1.6 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)總體積為20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，10 nmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR

1.7.1 實(shí)時熒光定量PCR體系和程序 反應(yīng)體系總體積為20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，RNase-Free ddH2O 6.4μL，10 nmol/L上、下游引物各0.8μL，cDNA 2μL。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對熔解曲線進(jìn)行分析。

1.7.2 實(shí)時熒光定量檢測與數(shù)據(jù)分析 熒光定量檢測利用Roche Light Cycler○R480Ⅱ型熒光定量PCR儀進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)檢測3次。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測和Real-time PCR熔解曲線

取2 μL下丘腦組織RNA點(diǎn)樣，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明RNA完整性良好，28S條帶亮度大于18S且二者均無明顯降解(圖1)。

圖1 小尾寒羊不同時期RNA電泳結(jié)果Fig.1 RNA electrophoretogram of different phases in Small Tail Han ewes

本研究以β-actin為內(nèi)參基因，F(xiàn)MR1為目的基因，熔解曲線如圖2所示。各樣品模板在反應(yīng)后期可得單峰、峰型銳利的熔解曲線，說明引物特異性良好，符合熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析的要求。

2.2 FMR1基因在綿羊組織中表達(dá)情況

半定量RT-PCR擴(kuò)增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，F(xiàn)MR1基因和β-actin持家基因片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。在小尾寒羊卵泡期18個組織的表達(dá)情況如圖3所示。

半定量RT-PCR結(jié)果表明，在卵泡期小尾寒羊中，β-actin基因在18個組織中均擴(kuò)增良好，具有明顯的內(nèi)參基因表達(dá)特征。FMR1基因在18個組織中均有表達(dá)，其中在大腦、小腦、卵巢(左、右)、輸卵管、子宮體、子宮角中高表達(dá)，在其它各組織呈中等或低豐度表達(dá)。

圖2FMR1基因的熔解曲線
Fig.2 Melting curve ofFMR1 gene

2.3 FMR1基因在不同時期繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

采用熒光定量PCR技術(shù)分別對處于卵泡期和黃體期的小尾寒羊FMR1基因在下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮體5個繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，結(jié)果如表2。

圖3FMR1基因在小尾寒羊的組織表達(dá)譜

M.DL2000 DNA Marker；1-18.下丘腦、垂體、大腦、小腦、甲狀腺、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、大腸、小腸、卵巢(左、右)、輸卵管、子宮體、子宮角

Fig.3 Tissue expression profile ofFMR1 gene in Small Tail Han sheep

M.DL2000 DNA Marker；1-18.hypothalamus, pituitary, brain, cerebellum, thyroid, heart, liver, spleen, lung, kidney, adrenal gland, large intestine, small intestine, ovary(left, right), oviduct, uterine body, uterine horn

表2 FMR1基因在小尾寒羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)量Table 2 Expression level of FMR1 gene in reproductive tissues in Small Tail Han sheep

注：同列肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。
Notes:Values with different lowercase superscripts in the same row show significant difference(P<0.05).

比較發(fā)現(xiàn)，在卵泡期小尾寒羊中，F(xiàn)MR1基因在垂體的表達(dá)量最高，輸卵管次之，子宮體最低。在黃體期小尾寒羊中，該基因在垂體的表達(dá)量最高，卵巢次之，子宮體最低。比較卵泡期和黃體期各組織的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因在卵泡期小尾寒羊各組織中的表達(dá)量均高于黃體期，且不同時期該基因在垂體的表達(dá)量最高，子宮體最低。其中在下丘腦、垂體、卵巢三個組織中卵泡期的表達(dá)量高于黃體期，但差異不顯著(P>0.05)，而在輸卵管和子宮體兩個組織中卵泡期的表達(dá)量顯著高于黃體期(P<0.05)。

3 討 論

發(fā)情是指雌性動物初情期后，受下丘腦-垂體-卵巢軸系調(diào)控的卵泡發(fā)育并分泌雌激素，雌激素進(jìn)而作用于大腦皮質(zhì)使雌性動物在生理和行為上發(fā)生變化的一種生理現(xiàn)象[13]。發(fā)情調(diào)控受卵泡發(fā)育和激素分泌等因素的影響，F(xiàn)MR1基因影響哺乳動物雌激素的分泌以及卵泡的數(shù)量。戴麗軍等[14]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因敲除小鼠雌激素水平顯著低于野生型小鼠。楊燕燕等[9]也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因敲除可影響小鼠性激素水平。FMRP在卵巢中高度表達(dá)，F(xiàn)MRP對卵巢功能可能有調(diào)控作用[15-16]。FMRP可調(diào)節(jié)卵巢的儲備功能，它的缺失可能影響其他調(diào)節(jié)繁殖功能的蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而影響繁殖功能[7,17-18]。而卵巢又是卵子生成和多種生殖激素分泌的重要場所，說明該基因可能通過影響激素的分泌影響哺乳動物的發(fā)情調(diào)控。Alcoba等[4]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因的表達(dá)和FSH的刺激密切相關(guān)，并且該基因表達(dá)的蛋白FMRP可能參與卵母細(xì)胞的成熟。Hoffman等[5]發(fā)現(xiàn)FMR1基因突變小鼠各級卵泡數(shù)量比正常小鼠少，顆粒細(xì)胞也較少。Lu等[6]也發(fā)現(xiàn)FMR1基因突變小鼠的卵泡數(shù)量降低，卵泡凋亡增加。Ferder等[7]發(fā)現(xiàn)FMR1基因?qū)Υ笫舐雅萆L起到調(diào)節(jié)作用。FMR1基因敲除大鼠的卵泡數(shù)量要少于野生型大鼠，且差異顯著[19]。這些研究結(jié)果提示FMR1基因與哺乳動物卵泡數(shù)量密切相關(guān)，可能會影響卵泡的正常生長和發(fā)育，從而對哺乳動物發(fā)情調(diào)控起到一定的作用。而本研究對FMR1基因在卵泡期和黃體期小尾寒羊各繁殖組織的表達(dá)差異進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因在卵泡期各繁殖組織的表達(dá)量均高于黃體期。說明該基因可能調(diào)控小尾寒羊卵泡期到黃體期發(fā)情狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，與小尾寒羊的發(fā)情調(diào)控相關(guān)，本研究結(jié)果與以上研究發(fā)現(xiàn)相符。

繁殖相關(guān)功能的調(diào)控非常復(fù)雜。目前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因?qū)Πl(fā)情調(diào)控的影響和神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY)的表達(dá)密切相關(guān)[19-20]。NPY是一種肽類物質(zhì)，廣泛分布于哺乳動物的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，與下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控密切相關(guān)，對排卵前的LH 峰有促進(jìn)作用[8,21]；同時NPY可影響卵巢的血流，調(diào)節(jié)卵泡的生長，影響卵泡的發(fā)育[22]。本研究通過比較FMR1基因在卵泡期和黃體期繁殖相關(guān)組織的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，該基因在垂體中的表達(dá)量最高，而小尾寒羊進(jìn)入卵泡期時，腺垂體分泌的LH會與FSH協(xié)同作用，促進(jìn)卵泡進(jìn)一步生長并分泌雌激素，雌激素分泌到一定數(shù)量時，作用于腺垂體，抑制FSH的分泌，同時刺激LH釋放，出現(xiàn)排卵前LH峰，引起卵泡的成熟破裂和排卵。排卵后，小尾寒羊由卵泡期進(jìn)入黃體期。因此，推測該基因在垂體中的表達(dá)量最高，可能是因?yàn)樗鼘ε怕亚癓H峰的形成以及卵泡的生長發(fā)育有促進(jìn)作用。這與以上NPY的相關(guān)研究結(jié)果一致，說明FMR1基因可能通過影響NPY的表達(dá)來促進(jìn)排卵前LH峰的形成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)小尾寒羊從卵泡期到黃體期的發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換。

4 結(jié) 論

本研究初步表明，F(xiàn)MR1基因可能會調(diào)控卵泡期到黃體期發(fā)情狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，與小尾寒羊的發(fā)情調(diào)控相關(guān)，但具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。