添加Se元素對Cu污染土壤磷酸酶活性的影響

李 晶， 王友保，王 鑫，郭璐韻

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)系，安徽 蚌埠233000；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖241000）

長期以來，隨著工農(nóng)業(yè)的大力發(fā)展，特別是其中金屬的開采與冶煉、農(nóng)田中化肥施用以及污水灌溉等人類活動(dòng)導(dǎo)致土壤中重金屬污染情況日趨嚴(yán)重，影響到人類的生產(chǎn)生活。重金屬Cu污染是近年來較為嚴(yán)重的問題［1-2］，也是研究熱點(diǎn)之一。安徽省銅陵市是重要產(chǎn)銅地區(qū)，銅礦大規(guī)模開采后形成很多尾礦，既占用了大量土地，也對附近環(huán)境造成一定污染。［3-4］土壤酶是土壤中的重要成分，各種生物化學(xué)過程以及物質(zhì)轉(zhuǎn)化都離不開酶的作用，土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)和肥力密切相關(guān)，同時(shí)也是土壤生物學(xué)性質(zhì)的體現(xiàn)。［5-6］有報(bào)道指出，重金屬污染土壤的土壤酶活性高低與污染程度呈一定負(fù)相關(guān)［7］，土壤酶活性變化可以作為土壤重金屬污染評價(jià)的指標(biāo)，其中，土壤Cu濃度增加可以顯著抑制土壤磷酸酶活性。

Se是環(huán)境中的微量元素，在人體和動(dòng)物代謝中具有多種生理功能，并且對重金屬有重要的拮抗作用。［8-9］缺Se能引起大骨節(jié)病、癌癥等多種疾病發(fā)生［10-11］，Se過量會(huì)產(chǎn)生毒害作用。施用Se肥對土壤磷酸酶、脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性有激活作用，能減少農(nóng)作物體內(nèi)自由基，從而提高作物的抗逆性。［12］由于Se主要通過酶的形式參與生物的生理作用［13］，因此Se和酶關(guān)系方面的研究進(jìn)展備受關(guān)注，Se對生物體內(nèi)酶的影響研究已有大量報(bào)道［11，14-15］，而Se與土壤磷酸酶活性關(guān)系的研究較少。本研究通過對不同程度Cu污染土壤中加入Se元素的試驗(yàn)，研究加Se濃度以及時(shí)間對Cu污染土壤磷酸酶活性的影響，以期得出改良Cu污染土壤的最適加Se濃度和時(shí)間，為銅尾礦區(qū)Cu污染土壤改良與再利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 供試土壤

土樣采自安徽省蕪湖市周邊的農(nóng)田土，采樣時(shí)先去除0～5 cm表層后，取5～20 cm土樣，保存?zhèn)溆?。用土壤農(nóng)化分析方法［16］測定土壤基本理化性質(zhì)，結(jié)果如表1所示。

表1 供試土樣的基本性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.3 測定方法

土壤磷酸酶活性的測定采用比色法測定土壤磷酸酶活性［18］。以1 g土37℃下培養(yǎng)2 h后酚變化的mg數(shù)（折算為100 g土中P2O5mg）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

表2 加Se和Cu培養(yǎng)5 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Se對土壤磷酸酶活性的影響

從表2可得，培養(yǎng)5 d，土壤磷酸酶活性隨土壤Cu含量的增加而減少，不加Se的土壤中，1 600 mg／kg Cu濃度的土壤磷酸酶活性較對照組下降率達(dá)到55.3%。這表明加入Cu尤其是高濃度Cu對土壤磷酸酶活性有著顯著抑制作用。而不加Cu的對照組，Se濃度為0.25～1.00 mg／kg時(shí)，土壤磷酸酶的活性逐漸增加，Se濃度為1.00 mg／kg時(shí)土壤中磷酸酶的活性達(dá)到最高，是不加Se組的1.06倍，之后下降。各個(gè)Cu處理濃度下，土壤磷酸酶活性均在加Se濃度為1.00 mg／kg達(dá)到最大值。由此可見，培養(yǎng)5 d時(shí)，Se含量為1.00 mg／kg，對土壤磷酸酶活性有促進(jìn)作用。Cu濃度升高，Se和Cu的拮抗作用表現(xiàn)就越顯著，與不加Se土壤磷酸酶活性對比中就可以看出，差異逐漸增大。培養(yǎng)5 d土壤磷酸酶活性和Se濃度之間的回歸分析如表3所示，不同Cu濃度下，土壤磷酸酶活性和Se濃度之間呈拋物線關(guān)系，Cu濃度為35 mg／kg時(shí)，沒有得到合適的回歸曲線。Cu濃度為100 mg／kg時(shí)，土壤磷酸酶活性和Se濃度之間呈顯著相關(guān)（p＜0.05），Cu濃度為 400、800、1 600 mg／kg 時(shí)，呈極顯著相關(guān)（p＜0.01）。

由表2和表3可得，隨著土壤Cu濃度提高，土壤磷酸酶的活性明顯受到抑制，培養(yǎng)5 d時(shí)，Se的加入能顯著提高磷酸酶的活性，當(dāng)Cu濃度大于400 mg／kg時(shí)，土壤磷酸酶活性與Se濃度呈極顯著相關(guān)。

土樣培養(yǎng)到25 d，隨著加入 Cu的濃度升高，土壤磷酸酶活性出現(xiàn)明顯下降（如表4所示）。1 600 mg／kg高Cu濃度時(shí)，土壤磷酸酶活性與對照組相比下降48.8%，抑制作用明顯。各個(gè)Cu處理組土壤中，Se濃度為0～1.00 mg／kg時(shí)，土壤磷酸酶活性隨Se濃度的增加而增大，Se濃度為1.0 mg／kg時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于不加Se土壤，之后各個(gè)Cu處理土壤磷酸酶略降低，仍大于不加Se土壤。

表3 土壤磷酸酶活性（y）與Se濃度（x）之間的關(guān)系

表4 加Se和Cu培養(yǎng)25 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

25 d時(shí)各Cu濃度下土壤磷酸酶活性和Se濃度之間都呈極顯著相關(guān)（如表5所示）。各Cu濃度處理中，土壤磷酸酶活性達(dá)到最大的Se濃度均在1.21～1.50 mg／kg之間。由表4和表5可得，Se能夠和重金屬Cu產(chǎn)生拮抗，從而降低重金屬Cu對于土壤磷酸酶活性抑制作用，同時(shí)單因素Se也能提高土壤磷酸酶活性。

表5 土壤磷酸酶活性（Y）與Se濃度（x）之間的關(guān)系

如表6，培養(yǎng)45 d不加Cu對照組在加Se濃度1.00 mg／kg時(shí)土壤磷酸酶活性有顯著提高，2.50 mg／kg后又有所下降；各Cu濃度處理土壤中，加Se在一定范圍內(nèi)能提高土壤酶活性。Se濃度為1.00 mg／kg時(shí)，各 Cu 處理土壤磷酸酶活性分別是不加 Se 土壤的 1.13、1.13、1.17、1.22、1.43 和 1.62 倍，差異顯著。 Se 濃度到 2.50 mg／kg 時(shí)，土壤磷酸酶活性分別是不加 Se 土壤的 1.00、0.93、1.08、1.16、1.17 和 1.44 倍，普遍高于不加Se土壤磷酸酶活性。因此在Cu污染較為嚴(yán)重的土壤中，加一定量的Se元素和Cu能產(chǎn)生拮抗作用，降低重金屬Cu對土壤磷酸酶活性的抑制作用，有利于提高土壤肥力。表7為培養(yǎng)45 d時(shí)各Cu濃度處理下，土壤磷酸酶活性和Se濃度之間都呈極顯著相關(guān)（p＜0.01）。經(jīng)回歸方程分析，Cu濃度在35、100、400、800、1 600 mg／kg 時(shí)，土壤磷酸酶活性達(dá)到最大值的 Se 濃度分別為 1.16、1.45、1.62、1.42、1.48 mg／kg。

表6 加Se和Cu培養(yǎng)45 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

培養(yǎng)到65 d，各Cu濃度處理中，加Se濃度為0～1.00 mg／kg的時(shí)候，土壤磷酸酶活性隨Se濃度的增加而增加（如表8 所示），加 Se 濃度為2.00～2.50 mg／kg 時(shí)，土壤磷酸酶活性略有降低，2.50 mg／kg Se 濃度下的土壤磷酸酶活性仍然大于不加Se土壤的磷酸酶活性。表9所示，培養(yǎng)65 d時(shí)，各Cu濃度下土壤磷酸酶活性和Se濃度之間都呈顯著或極顯著相關(guān)性。Cu濃度為35、100、400、800、1 600 mg／kg時(shí)，達(dá)到最大土壤磷酸酶活性的加 Se 濃度分別為 1.50、1.61、1.52、1.42、1.66 mg／kg。 總體來看，最適加 Se 濃度為1.00～2.00 mg／kg，這與培養(yǎng)45 d時(shí)一致。由表8和表9可見，隨著Se濃度的增加，磷酸酶活性提高，但當(dāng)Se濃度大于1.00 mg／kg時(shí)，土壤磷酸酶活性降低，且當(dāng)Cu濃度大于100 mg／kg時(shí)，土壤磷酸酶活性與Se濃度呈極顯著相關(guān)。

表7 土壤磷酸酶活性（y）與Se濃度（x）之間的關(guān)系

表8 加Se和Cu培養(yǎng)65 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

表9 土壤磷酸酶活性（y）與Se濃度（x）之間的關(guān)系

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對土壤磷酸酶活性的影響

通過土樣培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)可得，各培養(yǎng)時(shí)間段Se對Cu污染土壤磷酸酶活性均具有一定的促進(jìn)作用，將5 d的時(shí)間段作為起始點(diǎn)，分別用25 d、45 d和65 d中土壤磷酸酶活性相對于5 d時(shí)增長百分率的平均值，計(jì)算土壤磷酸酶活性變化幅度（如圖1所示）。由圖1得，Se濃度在0～2.50 mg／kg范圍時(shí)，培養(yǎng)25 d相對于5 d土壤磷酸酶活性增加百分率有所提高，到培養(yǎng)45 d時(shí)增加百分率最高，各Se濃度增加率分別為21.80%、23.91%、21.46%、22.29%和21.10%，之后隨著時(shí)間增加到 65 d 時(shí)，土壤中的磷酸酶活性增加率又有所下降。

圖1 土壤磷酸酶活性增加的百分率

3 討論

目前土壤酶作為一類土壤肥力評價(jià)的重要指標(biāo)，在研究重金屬對土壤影響中有著重要作用。其中土壤磷酸酶，在土壤中能催化磷酸二酯和磷酸單酯水解成為無機(jī)態(tài)的磷酸，土壤磷酸酶活性的高低影響土壤中有機(jī)磷的轉(zhuǎn)化和生物有效性。［19］本研究結(jié)果表明，重金屬Cu脅迫下，土壤中磷酸酶活性降低，土壤磷酸酶活性和Cu的濃度呈反比。這與馮丹等人［20］發(fā)現(xiàn)Cu顯著抑制土壤磷酸酶活性的研究結(jié)果一致。土壤磷酸酶在一定程度上可以作為Cu對土壤污染的程度表征。

Se是人體和動(dòng)物必需的元素，有研究表明，高濃度的Se對土壤磷酸酶具有顯著的抑制作用［21］，因此可用土壤磷酸酶活性變化作為土壤Se污染參考依據(jù)。研究表明，Cu污染土壤中，磷酸酶活性與加入的Se濃度呈顯著相關(guān)，加入一定量Se（2.0 mg／kg以內(nèi)），可以提高土壤磷酸酶活性。Se可以促進(jìn)酶和底物活化絡(luò)合物的速度，增加酶和底物作用的親和力［22］，同時(shí)Se和重金屬有著一定的拮抗作用［23］，因而加入Se以后，Cu污染土壤的磷酸酶活性有所增加。

影響土壤酶活性的因素很多，培養(yǎng)土壤過程中，時(shí)間效應(yīng)對于土壤酶活性的影響也不能忽視。在不同時(shí)間段土壤酶活性也會(huì)有所不同。和文祥等人［24］發(fā)現(xiàn)，將高濃度的As加入土壤中，在最初幾個(gè)月中土壤酶活性變化沒有什么規(guī)律，但當(dāng)As培養(yǎng)到1年時(shí)，可以看到對土壤脲酶具有一定的激活作用；楊蘭芳等人［5］研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍的Se在短時(shí)間內(nèi)（10 d）可促進(jìn)土壤蛋白酶活性，而長時(shí)間（30 d）加Se卻抑制其活性。所以，研究重金屬污染土壤的酶活性，不僅要研究在某個(gè)培養(yǎng)時(shí)間上的土壤酶變化情況，還應(yīng)盡可能研究不同培養(yǎng)時(shí)間段土壤酶活性的變化情況。Nowak等人［25］通過對土壤添加不同濃度的H2SeO3，培養(yǎng)112 d以上研究土壤酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)高濃度Se抑制土壤磷酸酶活性，而低濃度Se，土壤磷酸酶活性較對照前有所增加。本研究明，在Cu污染土壤中，加入Se的濃度為0～2.50 mg／kg范圍時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間25 d，相對于5 d，土壤磷酸酶活性增加百分率有所提高，培養(yǎng)45 d時(shí)增加百分率最高，這與Nowak等人的研究結(jié)果低濃度Se增加土壤磷酸酶活性一致。之后隨著培養(yǎng)時(shí)間增加到65 d時(shí)，土壤中的磷酸酶活性增加率又有所下降。45 d時(shí)，Se和Cu拮抗作用最為顯著，Cu對于土壤中磷酸酶活性的抑制作用降到最低點(diǎn)，磷酸酶活性增加幅度達(dá)到最大。65 d時(shí)，土壤磷酸酶活性降低，但相對于5 d時(shí)還是增加的。這可能是由于培養(yǎng)時(shí)間較長，Se對Cu的拮抗有所減弱，或者土壤中的微生物含量隨著時(shí)間的增加而減少，加上重金屬脅迫，導(dǎo)致磷酸酶活性下降。

有研究發(fā)現(xiàn)在銅陵尾礦區(qū)周圍農(nóng)田地受到Cu污染，土壤酶活性受到抑制［3，26］。采用一定的土壤改良的方法來治理被Cu嚴(yán)重污染的土壤刻不容緩，我國大部分地區(qū)土壤Se含量偏低，屬于缺Se地區(qū)［27］，如果在Cu污染的土壤中適量添加Se元素，既補(bǔ)充Se元素，也降低了Cu污染。

4 結(jié)論

（1）不同程度Cu污染的土壤，土壤磷酸酶活性受到抑制，特別是Cu濃度較高時(shí)，對土壤磷酸酶活性抑制越明顯。加入Se對于銅污染土壤的磷酸酶活性具有提高作用。

（2）在土壤 Cu 濃度 100～1 600 mg／kg范圍內(nèi)，添加 Se濃度 1.0～2.0 mg／kg最有利于提高 Cu 污染土壤的磷酸酶活性，加Se對Cu污染土壤中磷酸酶活性的影響顯著。

（3）從加Se的時(shí)間看，培養(yǎng)25 d、45 d、65 d時(shí)酶活性增幅大于5 d，其中45 d酶活性增幅最大。