miR
--200a與金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞生長及侵襲能力的影響

孫慶敏,王 進(jìn)

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部 南京 210029

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家尤為高發(fā)；中國胃癌患病人數(shù)占全世界的42%[1]。目前手術(shù)切除仍是原發(fā)性胃癌最主要的治療手段，但實(shí)際上手術(shù)時(shí)有可能就已經(jīng)發(fā)生了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此如何減少胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已成為提高胃癌療效的關(guān)鍵[2]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和對癌癥發(fā)病機(jī)制的深入研究，腫瘤的治療也正在發(fā)生變革，特別是精準(zhǔn)化治療概念提出之后，針對胃癌的治療更需結(jié)合病理、基因及蛋白組學(xué)等資料。諸多研究已經(jīng)證實(shí)miRNAs參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。我們之前的研究[3]證實(shí)miR--200a可抑制卵巢癌的侵襲，并與卵巢癌的臨床病理分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。諸多研究[4--5]已發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮通過影響一系列的細(xì)胞進(jìn)程如細(xì)胞周期、凋亡、血管新生等發(fā)揮抗癌作用。我們之前的研究[6--7]也發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可抑制胃癌7901細(xì)胞、葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖。因此，我們觀察了金雀異黃酮與miR--200a單用及聯(lián)用對胃癌細(xì)胞生長、侵襲的影響，并探討可能的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人胃癌細(xì)胞株MGC803、BGC823、MKN45由江蘇省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清(Hyclone公司)，miR--200a mimic、NC mimic(上海吉瑪基因公司)，金雀異黃酮(Sigma公司)，MTT檢測試劑盒(碧云天公司)，8 μm Transwell 小室(BD公司)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司)，Sybr green(Toyobo公司)，兔抗人EphA2 抗體、兔抗人GAPDH抗體(Santa Cruz公司)，Lipo--2000(Life Technologies公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，TaqMan?MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司)，Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(millipore，WBKLS0100)。德國Hettich MikrO 200R冷凍離心機(jī)，酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo fisher公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，ABI Prism 7300 PCR系統(tǒng)(ABI公司)，GloMax 96 微孔板發(fā)光檢測儀(Promega公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組取MGC803、BGC823、MKN45細(xì)胞，在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。

分別取MGC803、BGC823、MKN45細(xì)胞，接種于96孔板，每種細(xì)胞分別接種12孔，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分為4組(每組3孔)：陰性對照組(轉(zhuǎn)染NC mimic)、金雀異黃酮組(加入50 μmol/L金雀異黃酮)、miR--200a組、聯(lián)合組(miR--200a mimic轉(zhuǎn)染聯(lián)合50 μmol/L的金雀異黃酮處理)，6 h后，換成完全培養(yǎng)基。

1.3各組細(xì)胞生長情況3種細(xì)胞分別按照1.2分組處理后培養(yǎng)24 h，每孔加入50 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加入500 μL Formazan溶解液，直至在光學(xué)顯微鏡下觀察Formazan全部溶解，酶標(biāo)儀上于570 nm處測定吸光度(A)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零孔A值)/(對照組A值-調(diào)零孔A值)，其中對照組為不加任何處理的細(xì)胞。

1.4各組細(xì)胞侵襲能力的變化3種細(xì)胞分別按照1.2分組處理后，將1×104個(gè)細(xì)胞接種到Transwell的頂部室中，將含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基填充在底部室中。 24 h后，從膜的頂部除去非侵入性細(xì)胞。然后用甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液染色，100倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.5各組細(xì)胞EphA2mRNA表達(dá)的檢測3種細(xì)胞分別按照1.2分組處理后，提取RNA。采用熒光定量RT--PCR評估EphA2 mRNA的表達(dá)水平。EphA2正、反向引物(5'～3')：GGGACCTGATGCAG AACATC和AGTTGGTGCGGAGCCAGT;GAPDH：TGTTCGACAGTCAGCCGC和GGTGTCTGAGCGAT GTGGC。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算EphA2 mRNA的表達(dá)水平。

1.6各組細(xì)胞EphA2蛋白表達(dá)的檢測取BGC823和MKN45細(xì)胞，按照1.2分組處理48 h后在RIPA裂解緩沖液中裂解，蛋白通過100 g/L SDS--PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將膜與兔抗人EphA2抗體(按1 ∶200稀釋)或兔抗人GAPDH抗體一起孵育，加入二抗，ECL顯色，并用Quantity One軟件定量。以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)，采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析探討miR--200a和金雀異黃酮單用或聯(lián)用對胃癌細(xì)胞生長、侵襲能力及EphA2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞生長的影響MTT結(jié)果顯示，金雀異黃酮可抑制MGC803細(xì)胞生長，而miR--200a可抑制MKN45細(xì)胞生長，二者對這兩株細(xì)胞生長的影響均無交互作用。金雀異黃酮和miR--200a單用均可抑制BGC823細(xì)胞生長，且二者聯(lián)用有協(xié)同作用，見表1。

表1 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞存活率的影響

2.2miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響金雀異黃酮可抑制MGC803和MKN45細(xì)胞侵襲能力，而miR--200a可抑制MGC803和BGC823細(xì)胞侵襲能力，二者聯(lián)用對這3種細(xì)胞侵襲能力的影響均無交互作用。見表2。

表2 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2mRNA相對表達(dá)量的影響在MGC803細(xì)胞中未觀察到miR--200a或金雀異黃酮對EphA2 mRNA表達(dá)的影響；但在MKN45細(xì)胞中miR--200a可抑制EphA2 mRNA表達(dá)；在BGC823中金雀異黃酮可一定程度抑制EphA2 mRNA表達(dá)(P=0.054)。見表3。

表3 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2 mRNA相對表達(dá)量的影響

2.4miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2蛋白表達(dá)的影響miR--200a及金雀異黃酮均可抑制BGC823細(xì)胞EphA2蛋白的表達(dá)，且二者聯(lián)用有協(xié)同作用；MKN45細(xì)胞中，金雀異黃酮單用及與miR--200a聯(lián)用均可抑制EphA2蛋白表達(dá)。在MGC803細(xì)胞中，EphA2蛋白表達(dá)量極低，故未做給藥或轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。見圖1、表4。

1～4:分別為陰性對照組、miR--200a組、金雀異黃酮組及聯(lián)合組

圖1miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2蛋白表達(dá)的影響

表4 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

諸多研究[4--5]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮通過影響一系列的細(xì)胞過程如細(xì)胞周期、凋亡、血管新生等發(fā)揮抗癌作用。我們之前的研究[6]也發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可抑制胃癌7901細(xì)胞增殖。因此本研究我們擴(kuò)大在另外3株胃癌細(xì)胞中觀察金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞生長及侵襲的作用。結(jié)果顯示，金雀異黃酮單用可抑制MGC803、BGC823細(xì)胞生長及MGC803、MKN45細(xì)胞侵襲。

miR--200家族被發(fā)現(xiàn)與胃癌生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤程度及分級密切相關(guān)[8]，且諸多基于我國范圍內(nèi)的胃癌人群研究[9--11]已顯示miR--200a在胃癌中低表達(dá)，提示miR--200a在胃癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。鑒于此，本研究觀察了給予外源性miR--200a mimic是否可以抑制胃癌細(xì)胞生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR--200a可抑制胃癌細(xì)胞MKN45、BGC823生長，而且其與金雀異黃酮可協(xié)同抑制BGC823細(xì)胞生長。3種胃癌細(xì)胞株遺傳背景信息的差異可能是導(dǎo)致其協(xié)同效應(yīng)不一致的原因。此外，Transwell實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR--200a可抑制胃癌細(xì)胞MGC803和BGC823侵襲，這一發(fā)現(xiàn)為之后開發(fā)抗癌藥物提供了新途徑。

miRNAs通過與靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的3’非編碼區(qū)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。我們之前的研究通過生物信息學(xué)及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在卵巢癌中證實(shí)了EphA2為miR--200a的直接功能靶基因之一。因此，本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察同時(shí)轉(zhuǎn)染miR--200a及EphA2 3’UTR熒光質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR--200a可抑制其熒光活性，可見在胃癌中EphA2也為其靶基因之一，但是否為功能靶基因尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。EphA2作為蛋白酪氨酸激酶跨膜受體成員之一，與腫瘤的血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。前期研究[12]已發(fā)現(xiàn)EphA2陽性表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR--200a可抑制BGC823胃癌細(xì)胞中EphA2蛋白表達(dá)，且聯(lián)合金雀異黃酮可進(jìn)一步加強(qiáng)該作用。

綜上所述，miR--200a與金雀異黃酮可能通過調(diào)控EphA2抑制胃癌細(xì)胞生長及侵襲，且二者存在部分協(xié)同作用。上述實(shí)驗(yàn)研究為后期針對miR--200a或EphA2開發(fā)藥物提供了理論基礎(chǔ)，亦為miRNAs藥物聯(lián)合傳統(tǒng)藥物治療胃癌提供了研究基礎(chǔ)。