孫慶敏,王 進(jìn)
南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部 南京 210029
胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在發(fā)展中國家尤為高發(fā);中國胃癌患病人數(shù)占全世界的42%[1]。目前手術(shù)切除仍是原發(fā)性胃癌最主要的治療手段,但實(shí)際上手術(shù)時(shí)有可能就已經(jīng)發(fā)生了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此如何減少胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已成為提高胃癌療效的關(guān)鍵[2]。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和對癌癥發(fā)病機(jī)制的深入研究,腫瘤的治療也正在發(fā)生變革,特別是精準(zhǔn)化治療概念提出之后,針對胃癌的治療更需結(jié)合病理、基因及蛋白組學(xué)等資料。諸多研究已經(jīng)證實(shí)miRNAs參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。我們之前的研究[3]證實(shí)miR--200a可抑制卵巢癌的侵襲,并與卵巢癌的臨床病理分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。諸多研究[4--5]已發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮通過影響一系列的細(xì)胞進(jìn)程如細(xì)胞周期、凋亡、血管新生等發(fā)揮抗癌作用。我們之前的研究[6--7]也發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可抑制胃癌7901細(xì)胞、葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖。因此,我們觀察了金雀異黃酮與miR--200a單用及聯(lián)用對胃癌細(xì)胞生長、侵襲的影響,并探討可能的相關(guān)分子機(jī)制。
1.1材料人胃癌細(xì)胞株MGC803、BGC823、MKN45由江蘇省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清(Hyclone公司),miR--200a mimic、NC mimic(上海吉瑪基因公司),金雀異黃酮(Sigma公司),MTT檢測試劑盒(碧云天公司),8 μm Transwell 小室(BD公司),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司),Sybr green(Toyobo公司),兔抗人EphA2 抗體、兔抗人GAPDH抗體(Santa Cruz公司),Lipo--2000(Life Technologies公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司),TaqMan?MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司),Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(millipore,WBKLS0100)。德國Hettich MikrO 200R冷凍離心機(jī),酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo fisher公司),倒置顯微鏡(Olympus公司),ABI Prism 7300 PCR系統(tǒng)(ABI公司),GloMax 96 微孔板發(fā)光檢測儀(Promega公司)。
1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組取MGC803、BGC823、MKN45細(xì)胞,在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。
分別取MGC803、BGC823、MKN45細(xì)胞,接種于96孔板,每種細(xì)胞分別接種12孔,每孔約5 000個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后分為4組(每組3孔):陰性對照組(轉(zhuǎn)染NC mimic)、金雀異黃酮組(加入50 μmol/L金雀異黃酮)、miR--200a組、聯(lián)合組(miR--200a mimic轉(zhuǎn)染聯(lián)合50 μmol/L的金雀異黃酮處理),6 h后,換成完全培養(yǎng)基。
1.3各組細(xì)胞生長情況3種細(xì)胞分別按照1.2分組處理后培養(yǎng)24 h,每孔加入50 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后每孔加入500 μL Formazan溶解液,直至在光學(xué)顯微鏡下觀察Formazan全部溶解,酶標(biāo)儀上于570 nm處測定吸光度(A)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零孔A值)/(對照組A值-調(diào)零孔A值),其中對照組為不加任何處理的細(xì)胞。
1.4各組細(xì)胞侵襲能力的變化3種細(xì)胞分別按照1.2分組處理后,將1×104個(gè)細(xì)胞接種到Transwell的頂部室中,將含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基填充在底部室中。 24 h后,從膜的頂部除去非侵入性細(xì)胞。然后用甲醇固定細(xì)胞,結(jié)晶紫溶液染色,100倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù),取平均數(shù)。
1.5各組細(xì)胞EphA2mRNA表達(dá)的檢測3種細(xì)胞分別按照1.2分組處理后,提取RNA。采用熒光定量RT--PCR評估EphA2 mRNA的表達(dá)水平。EphA2正、反向引物(5'~3'):GGGACCTGATGCAG AACATC和AGTTGGTGCGGAGCCAGT;GAPDH:TGTTCGACAGTCAGCCGC和GGTGTCTGAGCGAT GTGGC。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算EphA2 mRNA的表達(dá)水平。
1.6各組細(xì)胞EphA2蛋白表達(dá)的檢測取BGC823和MKN45細(xì)胞,按照1.2分組處理48 h后在RIPA裂解緩沖液中裂解,蛋白通過100 g/L SDS--PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將膜與兔抗人EphA2抗體(按1 ∶200稀釋)或兔抗人GAPDH抗體一起孵育,加入二抗,ECL顯色,并用Quantity One軟件定量。以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù),采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析探討miR--200a和金雀異黃酮單用或聯(lián)用對胃癌細(xì)胞生長、侵襲能力及EphA2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.1miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞生長的影響MTT結(jié)果顯示,金雀異黃酮可抑制MGC803細(xì)胞生長,而miR--200a可抑制MKN45細(xì)胞生長,二者對這兩株細(xì)胞生長的影響均無交互作用。金雀異黃酮和miR--200a單用均可抑制BGC823細(xì)胞生長,且二者聯(lián)用有協(xié)同作用,見表1。
表1 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞存活率的影響
2.2miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響金雀異黃酮可抑制MGC803和MKN45細(xì)胞侵襲能力,而miR--200a可抑制MGC803和BGC823細(xì)胞侵襲能力,二者聯(lián)用對這3種細(xì)胞侵襲能力的影響均無交互作用。見表2。
表2 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響
2.3miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2mRNA相對表達(dá)量的影響在MGC803細(xì)胞中未觀察到miR--200a或金雀異黃酮對EphA2 mRNA表達(dá)的影響;但在MKN45細(xì)胞中miR--200a可抑制EphA2 mRNA表達(dá);在BGC823中金雀異黃酮可一定程度抑制EphA2 mRNA表達(dá)(P=0.054)。見表3。
表3 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2 mRNA相對表達(dá)量的影響
2.4miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2蛋白表達(dá)的影響miR--200a及金雀異黃酮均可抑制BGC823細(xì)胞EphA2蛋白的表達(dá),且二者聯(lián)用有協(xié)同作用;MKN45細(xì)胞中,金雀異黃酮單用及與miR--200a聯(lián)用均可抑制EphA2蛋白表達(dá)。在MGC803細(xì)胞中,EphA2蛋白表達(dá)量極低,故未做給藥或轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。見圖1、表4。
1~4:分別為陰性對照組、miR--200a組、金雀異黃酮組及聯(lián)合組
圖1miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2蛋白表達(dá)的影響
表4 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞EphA2 蛋白表達(dá)的影響
諸多研究[4--5]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮通過影響一系列的細(xì)胞過程如細(xì)胞周期、凋亡、血管新生等發(fā)揮抗癌作用。我們之前的研究[6]也發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可抑制胃癌7901細(xì)胞增殖。因此本研究我們擴(kuò)大在另外3株胃癌細(xì)胞中觀察金雀異黃酮對胃癌細(xì)胞生長及侵襲的作用。結(jié)果顯示,金雀異黃酮單用可抑制MGC803、BGC823細(xì)胞生長及MGC803、MKN45細(xì)胞侵襲。
miR--200家族被發(fā)現(xiàn)與胃癌生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤程度及分級密切相關(guān)[8],且諸多基于我國范圍內(nèi)的胃癌人群研究[9--11]已顯示miR--200a在胃癌中低表達(dá),提示miR--200a在胃癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。鑒于此,本研究觀察了給予外源性miR--200a mimic是否可以抑制胃癌細(xì)胞生長,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR--200a可抑制胃癌細(xì)胞MKN45、BGC823生長,而且其與金雀異黃酮可協(xié)同抑制BGC823細(xì)胞生長。3種胃癌細(xì)胞株遺傳背景信息的差異可能是導(dǎo)致其協(xié)同效應(yīng)不一致的原因。此外,Transwell實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR--200a可抑制胃癌細(xì)胞MGC803和BGC823侵襲,這一發(fā)現(xiàn)為之后開發(fā)抗癌藥物提供了新途徑。
miRNAs通過與靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的3’非編碼區(qū)結(jié)合,從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。我們之前的研究通過生物信息學(xué)及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在卵巢癌中證實(shí)了EphA2為miR--200a的直接功能靶基因之一。因此,本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察同時(shí)轉(zhuǎn)染miR--200a及EphA2 3’UTR熒光質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR--200a可抑制其熒光活性,可見在胃癌中EphA2也為其靶基因之一,但是否為功能靶基因尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。EphA2作為蛋白酪氨酸激酶跨膜受體成員之一,與腫瘤的血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。前期研究[12]已發(fā)現(xiàn)EphA2陽性表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR--200a可抑制BGC823胃癌細(xì)胞中EphA2蛋白表達(dá),且聯(lián)合金雀異黃酮可進(jìn)一步加強(qiáng)該作用。
綜上所述,miR--200a與金雀異黃酮可能通過調(diào)控EphA2抑制胃癌細(xì)胞生長及侵襲,且二者存在部分協(xié)同作用。上述實(shí)驗(yàn)研究為后期針對miR--200a或EphA2開發(fā)藥物提供了理論基礎(chǔ),亦為miRNAs藥物聯(lián)合傳統(tǒng)藥物治療胃癌提供了研究基礎(chǔ)。