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      新疆地方綿羊ND2基因多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育分析

      2018-08-01 07:53:22王世鋒米耶斯?fàn)?/span>詹建立張秀英王玉濤
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年13期
      關(guān)鍵詞:多浪塔什庫(kù)爾干世系

      王世鋒, 米耶斯?fàn)枺?詹建立, 張秀英, 王玉濤

      (喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆喀什 844000)

      綿羊與人類(lèi)生活密切相關(guān),為人類(lèi)提供了肉、脂、奶、皮、毛、絨、骨和角等多種多樣的畜產(chǎn)品[1-3]。關(guān)于綿羊的起源仍存在爭(zhēng)議,線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)序列分析已經(jīng)確定了一種多母系血統(tǒng)的普遍現(xiàn)象,即A、B、C、D、E進(jìn)化世系,這些世系有特定的地理范圍,暗示多重母系起源,羊馴化事件可能是獨(dú)立的[4]。目前,研究發(fā)現(xiàn)僅歐洲摩弗倫羊可能是家綿羊的母系(世系B)野生祖先之一。推測(cè)亞洲摩弗倫羊與歐洲摩弗倫羊與家綿羊共享最近的母系祖先[5],未發(fā)現(xiàn)其他野生羊?qū)揖d羊有遺傳貢獻(xiàn)的分子證據(jù)。

      線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞的動(dòng)力車(chē)間,mtDNA作為獨(dú)立與核DNA的半自主性基因組,是核外遺傳物質(zhì),動(dòng)物體線(xiàn)粒體基因組編碼的37個(gè)基因,包括13條多肽,22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因[6],具有分子量小、進(jìn)化速度快、多挎貝、堿基替換率低、遺傳自主及母系遺傳等特征。

      ND2基因是mtDNA的1個(gè)蛋白編碼基因,而且是NADH脫氫酶的1個(gè)亞基,而NADH脫氫酶是呼吸鏈復(fù)合體1的主要組成,在呼吸鏈中直接參與氫與電子傳遞并通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,進(jìn)而參與能量代謝作用。NAD參與生物體內(nèi)的重要反應(yīng),NAD可在糖酵解途徑與三羧酸循環(huán)途徑得到電子形成NADH,NADH又在氧化磷酸化途徑中將電子通過(guò)呼吸鏈最終傳遞給氧,促成ATP的形成[7]。在體內(nèi)大多數(shù)代謝脫下的氫,是由NADH呼吸鏈傳遞給氧,糖類(lèi)碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的分解代謝,脫氫后的氧化反應(yīng)一般是由NADH呼吸鏈傳遞完成的。

      魯衛(wèi)衛(wèi)等報(bào)道雞線(xiàn)粒體ND2基因的異質(zhì)性,并發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性變異對(duì)生長(zhǎng)性狀、屠體指標(biāo)、血清生化等指標(biāo)均有顯著效應(yīng),顯示相關(guān)變異的潛在重要性[7]。鮑海港等在對(duì)藏雞的研究中發(fā)現(xiàn),線(xiàn)粒體ND1和ND2基因可被選為藏雞低氧遺傳適應(yīng)的候選基因,因?yàn)榈脱鯐?huì)抑制與線(xiàn)粒體呼吸功能密切相關(guān)的酶的活性,也會(huì)使線(xiàn)粒體產(chǎn)生更多的活性氧?;钚匝鯐?huì)破壞膜脂,降低線(xiàn)粒體呼吸酶的活性,從而損害線(xiàn)粒體的呼吸功能。研究發(fā)現(xiàn),3種雞都有但頻率差異較大的2個(gè)錯(cuò)義突變都是ND2基因上的單堿基突變,推測(cè)藏雞與低地雞有可能在NADH脫氫酶的功能上存在差異[8]。而有關(guān)高山放牧品種的塔什庫(kù)爾干羊(海拔3 000~5 000 m)、和田羊(分為山區(qū)型和農(nóng)區(qū)型,海拔1 440~3 500 m)和多浪羊(海拔1 200 m)線(xiàn)粒體呼吸功能和低氧適應(yīng)研究較少。

      本研究通過(guò)測(cè)定綿羊線(xiàn)粒體ND2基因序列,從而探討新疆南疆地區(qū)綿羊的遺傳多樣性、線(xiàn)粒體呼吸功能及低氧適應(yīng)的分子機(jī)制,從而了解并摸清其親緣關(guān)系及低氧適應(yīng)性,為能夠綜合開(kāi)發(fā)和合理利用綿羊資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

      于2014年3月至2015年8月先后在麥蓋提縣種羊場(chǎng)采集33只多浪羊、塔什庫(kù)爾干縣麻扎種羊場(chǎng)采集41只塔什庫(kù)爾干羊、和田市屠宰場(chǎng)采集17只和田羊共計(jì)91只羊的靜脈血液,用檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝,冷凍后置于冰袋中,于實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2 主要試劑

      糞便基因組DNA快速提取試劑盒、全血基因組DNA快速提取試劑盒,均購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司;TaqDNA聚合酶、dNTP,均為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖為BIOWEST公司產(chǎn)品。

      1.3 總DNA提取

      綿羊總基因組DNA的提取是利用全血基因組DNA快速提取試劑盒(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

      1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

      根據(jù)綿羊mtDNA序列(GenBank登錄號(hào)為AF010406),采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增綿羊ND2基因,上游引物:5′-AGCACCCACTGATTGCTCAT-3′,下游引物:5′-TTCGTTTTGTGGTTGGGAAT-3′。委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成,期望擴(kuò)增長(zhǎng)度約901 bp。

      PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL:綿羊總基因組4 μL,10×Buffer(含Mg2+)5 μL,上下游引物各2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,TaqDNA聚合酶1 μL,去離子水29 μL。

      PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。

      PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送北京三博遠(yuǎn)志生物公司測(cè)序。

      1.5 數(shù)據(jù)分析

      應(yīng)用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)并手工校對(duì)。DnaSP 5.1軟件計(jì)算單倍型多樣度、核苷酸多樣度、多態(tài)位點(diǎn)、核苷酸總變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和點(diǎn)突變位點(diǎn)等。MEGA 5.1 軟件分析變異位點(diǎn),計(jì)算堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比(Ts/Tv)、核苷酸差異和序列差異,采用鄰接法(Neighbour-Joining,簡(jiǎn)稱(chēng)NJ)Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),對(duì)拓?fù)鋱D進(jìn)行重復(fù)抽樣1 000次的自展檢驗(yàn)(Bootstrap)以確定各分支的置信度。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 ND2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

      ND2基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳20 min,結(jié)果見(jiàn)圖1。

      電泳條帶明亮,擴(kuò)增效果較好,擴(kuò)增條帶大小為900 bp左右,與預(yù)期擴(kuò)增的901 bp一致??梢灾苯訙y(cè)序。

      2.2 綿羊mtDNA-ND2全序列堿基分析

      測(cè)序結(jié)果表明,所測(cè)出的綿羊mtDNA-ND2基因A、T、C、G含量在綿羊中分布較一致,其中A占36.8%,T占 27.4%,C占27.1%,G占8.7%。綿羊的A+T含量為 64.2%,C+G含量為35.8%,A+T含量高于C+G含量;表明綿羊mtDNA-ND2基因含有大量的堿基A和T,存在一定的堿基偏倚性。堿基組成表明G相對(duì)缺乏,其中密碼子第3位上G的含量最低,僅為2.6%;第3位的A含量較高,為49.8%。密碼子的使用存在一定差異,在密碼子的第1位上A高達(dá)43.4%;密碼子第2位上T的含量高達(dá)45.0%,堿基G的含量為9.1%。

      2.3 綿羊mtDNA-ND2序列的多樣性分析

      利用DnaSP 5.1軟件進(jìn)行單倍型統(tǒng)計(jì)分析,本試驗(yàn)分析91個(gè)綿羊mtDNA-ND2基因序列,發(fā)現(xiàn)了22個(gè)多態(tài)位點(diǎn),其中有9個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn),簡(jiǎn)單信息位點(diǎn)(2個(gè)堿基)有13個(gè)(圖2)。其中438、504、837、873位點(diǎn)核酸變異只出現(xiàn)在塔什庫(kù)爾干羊個(gè)體中。核酸變異中轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)大于顛換,轉(zhuǎn)換/顛換比為78.38。

      2.4 ND2氨基酸分析

      22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中的2個(gè)位點(diǎn)即299、883位點(diǎn)是非同義突變,分別導(dǎo)致M變?yōu)門(mén)和R變?yōu)镚,其余20個(gè)位點(diǎn)為同義突變。應(yīng)用SWISS-MODEL(httP://swissmodel.expasy.org/interactive# structure)軟件進(jìn)行ND2結(jié)構(gòu)在線(xiàn)預(yù)測(cè),多肽空間結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

      單倍型H1序列未發(fā)生突變,H8序列在299位點(diǎn)和883位點(diǎn)均發(fā)生突變。由圖3可知,突變后空間結(jié)構(gòu)差異不大。但是QMEAN分別為-4.35和-4.38,Cβ分別為-1.72和 -1.82,All Atom分別為-1.27和-13.2,Torsion分別為 -4.32 和-4.33,Solvation均為1.47,未發(fā)生變化。

      2.5 mtDNA-ND2基因單倍型分析

      共獲得13個(gè)單倍型,各單倍型在各品種中分布見(jiàn)表1。

      由表1可知,H2和H1為優(yōu)勢(shì)單倍型,分別占58.3%和13.2%。綿羊群體單倍型多樣度(Hd)為0.641,核苷酸多樣度(Pi)為:0.357%,平均核苷酸差異數(shù)(k)為3.4。塔什庫(kù)爾干羊、和田羊和多浪羊核苷酸多樣度分別為0.330%、0.135%、0.463%。

      2.6 綿羊系統(tǒng)進(jìn)化分析

      利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建綿羊ND2基因不同單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。其中包括GenBank下載的36個(gè)序列分別是A世系(HM236174-5)、B世系(AM236176-7)、C世系(AM236178-9)、D世系(HM236180-1)、E世系(HM236182-3)序列、盤(pán)羊線(xiàn)粒體序列(藏盤(pán)羊JX101654.1、帕米爾盤(pán)羊KT781689.1、Darwini盤(pán)羊KX609626.1、東方盤(pán)羊NC020656.1、HM236188.1、加拿大盤(pán)羊NC015889.1、JN181255.1)、Vignei(HM236186.1、HM236187.1、HM236189.1、NC026064.1、KF938361)、摩弗倫羊(HM236185、KF312238.1、KF938360.1、NC026063.1)、新疆地方綿羊阿勒泰羊(KF938320.1)、和田羊(KF938322.1)、吐魯番黑羊(KF938324.1)、巴什拜羊(KF938330.1)巴音布魯克羊(KF938331.1)、多浪羊(KF938332.1)、哈薩克羊(KF938333.1)、塔什庫(kù)爾干羊(KF938337.1)、葉城羊(KF938338.1)。

      表1 各單倍型在各品種中的分布

      由圖4可知,單倍型H2、H3、H9、H10、H11和H13屬于A世系;單倍型H1、H4和H7與歐洲摩弗侖羊和亞洲摩弗倫羊?qū)儆贐世系;H5、H6和H8與塞浦路斯摩弗倫羊?qū)儆贑世系;H12屬D世系。

      2.7 3個(gè)品種間的遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

      利用MEGA 5.0計(jì)算不同品種間遺傳距離(表2),根據(jù)遺傳距離構(gòu)建不同品種間NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖5)。由圖5可知,塔什庫(kù)爾干羊與和田羊關(guān)系較近,其次是多浪羊。

      表2 3個(gè)品種間的遺傳距離

      3 討論

      綿羊的A+T含量為64.2%,C+G含量為35.8%,A+T含量高于C+G含量;表明綿羊mtDNA-ND2基因含有大量的堿基A和T,存在一定的堿基偏倚性,與筆者前期研究結(jié)果[9-10]一致。

      基因變異發(fā)生在密碼子第1、2、3位置分別占9.09%、4.55%、86.36%,與前期研究結(jié)果[9]一致。

      轉(zhuǎn)換顛換比78.38遠(yuǎn)大于36.81[9]和轉(zhuǎn)換顛換比的臨界值2,說(shuō)明新疆南疆地區(qū)地方綿羊ND2基因序列突變可能未達(dá)到飽和狀態(tài),轉(zhuǎn)換隨著遺傳變異增加趨于飽和。

      馬麗娜等在蒙古羊和小尾寒羊上發(fā)現(xiàn)770位點(diǎn)上發(fā)生了T到C的轉(zhuǎn)換[11],本研究未發(fā)現(xiàn)此變異。

      438、504、837、873位點(diǎn)核酸變異只出現(xiàn)在塔什庫(kù)爾干羊個(gè)體中,單倍型H3、H4、H10和H13也只分布于塔什庫(kù)爾干羊中,是否與其N(xiāo)ADH脫氫酶功能差異和低氧適應(yīng)有聯(lián)系,仍需進(jìn)一步研究。另外單倍型H8序列在299位點(diǎn)和883位點(diǎn)均發(fā)生突變。突變后ND2亞基空間結(jié)構(gòu)差異不大,但是多肽部分性質(zhì)發(fā)生改變,是否影響線(xiàn)粒體呼吸功能有待進(jìn)一步探討。

      單倍型H12只分布于多浪羊中,與D世系聚在一起,表明多浪羊存在世系D,與基于細(xì)胞色素b的分析結(jié)果[9]一致。和田羊未發(fā)現(xiàn)世系C,可能與研究樣品數(shù)量偏少有關(guān)。

      3個(gè)品種平均核苷酸多樣度(Pi)為0.357%,塔什庫(kù)爾干羊、和田羊和多浪羊核苷酸多樣度分別為0.330%、0.135%、0.463%,低于趙倩君等[12]、王昕等[13]、張傳生等[14]基于細(xì)胞色素b研究的0.805%、0.602%、0.850%。但與筆者基于細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因分析塔什庫(kù)爾干羊的0.421%接近。

      基于ND2基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)表明摩弗倫羊可能是家綿羊世系B的野生祖先,與前人研究觀點(diǎn)[5]一致。但是塞浦路斯摩弗倫羊與是世系C聚在一起,可能對(duì)世系C有遺傳貢獻(xiàn),此觀點(diǎn)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外塔什庫(kù)爾干羊與和田羊關(guān)系較近,其次是多浪羊,此觀點(diǎn)與湯存?zhèn)サ然谖⑿l(wèi)星的分析結(jié)果[15]一致。

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