申紅春

(恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

鴨大腸桿菌病是由特定致病性血清型大腸桿菌引起的鴨不同病型大腸桿菌病的總稱(chēng)，該病的發(fā)病率和死亡率較高，臨床表現(xiàn)為急性敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎、臍炎等，是鴨養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)的細(xì)菌性傳染病之一。致病性大腸桿菌可感染不同階段的鴨，尤其是2～6周齡鴨最易感，發(fā)病率為25%～40 %，死亡率可達(dá)50%，該病主要通過(guò)呼吸道、生殖道感染和種蛋污染等多種途徑傳播[1-2]。中草藥具有低殘留、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽的養(yǎng)殖中。急性、亞慢性毒性試驗(yàn)是用來(lái)評(píng)價(jià)新的藥物的研發(fā)和臨床使用的安全性，急性毒性試驗(yàn)是驗(yàn)證藥物在短期內(nèi)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的毒性，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物1次或者24 h內(nèi)多次給藥，亞慢性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期使用毒性作用[3-4]。本試驗(yàn)對(duì)篩選出來(lái)的抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑采用急性、亞慢性毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)其使用的安全性，為復(fù)方中草藥制劑防治鴨致病性大腸桿菌臨床的安全使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 黃柏、甘草、板藍(lán)根、白頭翁、秦皮等中藥飲片，購(gòu)自北京同仁堂大藥房恩施分店；按照相應(yīng)的比例組合后烘干超微粉碎，制備的復(fù)方中草藥制劑用滅菌水制成混懸液，濃度為500 mg/mL。

1.2 主要儀器與試劑 生化試劑盒谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)，均購(gòu)自南京建成生物工程公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀、ND2000C型分光光度計(jì)，均由德國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；常規(guī)的儀器和試劑由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡的健康雛鴨240只，購(gòu)自某養(yǎng)殖場(chǎng)，用不含中草藥添加劑和抗生素的全價(jià)日糧飼喂至14日齡進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 急性毒性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)試驗(yàn)，將體重98 g±2 g的14日齡雛鴨90只，分成9組，每組10只，第1～8組通過(guò)灌胃的方式給藥2 mL，劑量分別0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 g/(kg·bw/d) 的復(fù)方中草藥制劑混懸液(濃度500 mg/mL)，9組給予等量的生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，記錄每個(gè)試驗(yàn)組中毒時(shí)間、癥狀及死亡數(shù)量，并計(jì)算LD50。當(dāng)試驗(yàn)結(jié)束后將試驗(yàn)鴨撲殺，觀察體內(nèi)的組織器官的病變情況。

1.5 最大耐受量試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)試驗(yàn)，將體重為98 g±2 g的14日齡雛鴨40只，分成4組，每組10只，1～3組通過(guò)灌胃的方式給藥2 mL，給藥劑量分別為5，15，25 g/(kg·bw/d) 的復(fù)方中草藥制劑混懸液(濃度500 mg/mL)，4組給予等量的生理鹽水，觀察7 d，記錄中毒時(shí)間、癥狀及死亡數(shù)量，試驗(yàn)結(jié)束將試驗(yàn)鴨撲殺，觀察組織器官的病理變化，并采集肝、腎等器官做組織病理學(xué)觀察。

1.6 亞慢性毒性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[7]，選擇14日齡體重大約98 g±2 g雛鴨80只，平均分成4組，每組20只，1組為對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，2～4組在基礎(chǔ)日糧添加20、40、80 g/(kg·bw/d)的復(fù)方中草藥制劑至42 d日齡，試驗(yàn)結(jié)束后再飼養(yǎng)14 d。在試驗(yàn)期間，給藥后的14 d，28 d進(jìn)行稱(chēng)重，并隨機(jī)抽取5只雛雞采血后剖檢，以檢測(cè)肝、腎功能指標(biāo)和肝、腎等器官組織病理學(xué)變化，記錄每個(gè)試驗(yàn)組的中毒時(shí)間、癥狀及死亡數(shù)量及相應(yīng)的病變情況。各個(gè)試驗(yàn)組試驗(yàn)雛鴨停藥后繼續(xù)觀察14 d，進(jìn)行稱(chēng)重。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，以(P<0.05) 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 在急性毒性試驗(yàn)中，各個(gè)試驗(yàn)組的試驗(yàn)雛鴨的采食與飲水均正常，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象及死亡情況，故計(jì)算不出LD50。試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)抽取5只試驗(yàn)雛鴨進(jìn)行剖檢，肝、腎等主要器官未出現(xiàn)明顯的病變。

2.2 最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果 在最大耐受量試驗(yàn)中3個(gè)試驗(yàn)組的試驗(yàn)雛鴨采食與飲水均正常，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象及死亡情況。每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)抽取5只試驗(yàn)雛鴨進(jìn)行剖檢未見(jiàn)明顯病理變化，肝、腎等主要器官病理組織學(xué)觀察，未見(jiàn)出現(xiàn)病變。試驗(yàn)雛鴨的最大耐受量超過(guò)了25 g/(kg·bw/d)。

2.3 亞慢性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 臨床及病理觀察結(jié)果 在亞慢性毒性試驗(yàn)中，各個(gè)試驗(yàn)組未發(fā)生死亡，采食與飲水正常，未出現(xiàn)死亡的。每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)抽取5只試驗(yàn)雛鴨進(jìn)行剖檢，肝、腎等主要器官未出現(xiàn)病變，其病理組織學(xué)觀察也未見(jiàn)異常變化。

2.3.2 體重的變化結(jié)果 由表1可見(jiàn)，在試驗(yàn)后的第14天， 1組與2組試驗(yàn)雛鴨的體重相比差異不顯著(P>0.05)，3組和4組的試驗(yàn)雛鴨的體重與1組相比差異顯著(P<0.05)。在試驗(yàn)后的28 d和停藥后的14 d，2組、3組、4組試驗(yàn)雛鴨的體重與1組相比，差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表1 復(fù)方中草藥制劑對(duì)雛鴨體重的影響 (g)

注:同列數(shù)據(jù)小寫(xiě)字母或者無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)小寫(xiě)字母不相同表示差異顯著(P<0.05)，下表同

3.3.3 肝、腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 由表2可知，在試驗(yàn)后的14 d、28 d，2組、3組、4組試驗(yàn)雛鴨血清中的GPT、GOT的含量與1組相比，均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

由表3可知，在試驗(yàn)后的14 d、28 d，2～4組試驗(yàn)雛鴨血清中的BUN含量呈下降趨勢(shì)，其中，2組、3組、4組與1組相比，差異顯著(P<0.05)，但2組、3組、4組之間差異不顯顯著(P>0.05)； 2組、3組、4組試驗(yàn)雛鴨血清中的的UA的含量與1組相比，差異顯著 (P<0.05)，2組、3組、4組之間差異性不顯顯著(P>0.05)。

表2 復(fù)方中草藥制劑對(duì)雛鴨血清中GPT，GOT含量的影響 (mmol/L)

表3 不同濃度的復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞血清中BUN，UA含量的影響 (mmol/L)

3 討論

急性毒性試驗(yàn)是短期內(nèi)對(duì)受試動(dòng)物多次給藥，驗(yàn)證其藥物的毒性，應(yīng)用于新的藥物的研發(fā)與安全性評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)對(duì)篩選出來(lái)的抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑，進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)，評(píng)其使用的安全性。結(jié)果顯示，結(jié)果未檢LD50，最大耐受量試驗(yàn)中，試驗(yàn)雛鴨飲水與采食正常，未出現(xiàn)死亡情況，剖檢后肝、腎等主要器官未出現(xiàn)病變，且病理組織學(xué)觀察也無(wú)異常變化，抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑對(duì)雛鴨耐受量、給藥量超過(guò)了25 g/(kg·bw/d)，[相當(dāng)于復(fù)方中草藥生藥量25 g/(kg·bw/d)]。與張召興[7]報(bào)道的一致。

在亞慢性毒性試驗(yàn)中，結(jié)果顯示，試驗(yàn)雛鴨飲水與采食正常，未出現(xiàn)死亡情況，剖檢變化與病理組織學(xué)檢查也未見(jiàn)異常。在試驗(yàn)后的14 d，3組和4組試驗(yàn)雛鴨體重顯著低于1組，這可能由于飼料中添加復(fù)方中草藥制劑中藥，影響試驗(yàn)雛鴨的采食量，因而影響試驗(yàn)雛鴨的體重，在試驗(yàn)后的28 d及停藥后的14 d，試驗(yàn)組雛鴨體重與對(duì)照組比較無(wú)顯著的差異。與李應(yīng)超等[5]報(bào)道的一致。肝臟是體內(nèi)重要的解毒器官，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體物質(zhì)代謝異常、紊亂等，血清中的GOT和GPT的含量增加。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用復(fù)方中草藥制劑后，血清中的GPT和GOT含量與對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異，證實(shí)該制劑肝臟無(wú)損傷作用，與官麗輝等[8]，索朗扎西等[9]等報(bào)道的一致。腎臟是主要的排泄器官，血清中UA和BUN含量是腎功能主要的指標(biāo)[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組雛鴨血清中的BUN、UA含量低于對(duì)照組，因而證實(shí)了該制劑對(duì)腎臟無(wú)損傷作用，可以提高雛鴨腎臟的代謝水平。與張召興[9]報(bào)道的一致。本試驗(yàn)對(duì)抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑在臨床中安全應(yīng)用提供參考依據(jù)。