景永帥蘇 蕾韓 鈺張丹參張瑞娟吳蘭芳鄭玉光秦 璇

(1. 河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2. 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；3. 石家莊市第二醫(yī)院康復(fù)國(guó)際部，河北 石家莊 050062)

北沙參為藥用植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. schmidt ex Miq.)的根，被《本草綱目》列為五參之一，是衛(wèi)生部公布的藥食兩用資源，具有清補(bǔ)肺陰、和中降逆、涵養(yǎng)肝陰等效果[1-2]。主要有效成分為揮發(fā)油類、香豆素類、多糖類、苷類和聚炔類等，其中多糖類是含量最高的成分，具有抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能[2-3]。

目前，對(duì)于北沙參多糖的研究，主要集中于提取工藝優(yōu)化和生物活性研究，如榮立新等[4]通過(guò)制備陰虛小鼠模型，檢測(cè)脾臟NK細(xì)胞殺傷活力、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能和小鼠血清抗綿羊紅細(xì)胞抗體IgM含量，發(fā)現(xiàn)北沙參多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。相美榮等[5]通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，優(yōu)化了北沙參多糖的熱水浸提工藝，得到北沙參多糖的最大提取率為10.78%。與傳統(tǒng)的熱水浸提工藝相比，超聲波輔助提取法因具有效率高、操作時(shí)間短、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，在食品和中藥行業(yè)中有較好的應(yīng)用[6]。但是，對(duì)于超聲波最優(yōu)工藝提取的北沙參多糖的理化性質(zhì)和生物活性未見相關(guān)研究報(bào)道。

本試驗(yàn)擬選用超聲波輔助提取法提取北沙參多糖，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)北沙參多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定北沙參多糖的理化性質(zhì)和生物活性，為北沙參多糖成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

北沙參：河北安國(guó)產(chǎn)，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室鄭玉光教授鑒定為傘形科珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. schmidt ex Miq.)的根；

α-葡萄糖苷酶：1.0×105U/g，上海源葉生物科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH)：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

恒溫水浴鍋：HH-2型，江蘇金壇宏華儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELAN-1100型，東京理化株式會(huì)社；

超聲波清洗器：KS-300DE型，昆山潔力美超聲儀器有限公司；

多功能中藥粉碎機(jī)：400Y型，永康市鉑歐玉金制品有限公司；

紫外-可見分光光度計(jì)：UV-2550型，島津儀器制造有限公司；

高速離心機(jī)：TGL-15B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

電子分析天平：AL204型，梅特勒-托利國(guó)際貿(mào)易有限公司；

差熱—熱重聯(lián)用熱分析儀：STD-2960型，美國(guó)TA儀器公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：S-100型，珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 取北沙參藥材200.0 g，粉碎，過(guò)40目篩，用3倍體積的95%乙醇回流提取2次，除去脂溶性成分，藥渣50 ℃干燥后，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

(1) 超聲提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響：固定超聲提取溫度60 ℃，液料比20∶1 (mL/g)，分別考察超聲提取時(shí)間(10，20，30，40 min)對(duì)多糖提取率的影響。

(2) 超聲提取溫度對(duì)北沙參多糖提取率的影響：在液料比20∶1 (mL/g)、超聲提取時(shí)間20 min的條件下，分別考察超聲提取溫度(20，40，60，80，90 ℃)對(duì)多糖提取率的影響。

(3) 液料比對(duì)多糖提取率的影響：固定超聲提取溫度60 ℃，超聲提取時(shí)間20 min，分別考察液料比為[10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1 (mL/g)]對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面分析 在單因素考察的基礎(chǔ)上，以北沙參多糖提取率作為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，得到回歸方程，確定多糖的最佳工藝條件，并重復(fù)最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8.0及Excel對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.4 北沙參多糖的理化性質(zhì)測(cè)定

(1) 紫外-可見光譜分析：配制0.1 mg/mL的北沙參多糖溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在200～700 nm掃描[7]。

(2) 紅外光譜分析：稱取1.0 mg的北沙參多糖，與KBr粉末混勻后壓片，紅外光譜儀在4 000～500 cm-1波數(shù)內(nèi)掃描[8]。

(3) 總糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[9]。

(4) 蛋白含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法[10]。

(5) 熱重分析：稱取2.0 mg的北沙參多糖，溫度由室溫升至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，進(jìn)行熱重分析，包括：差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry，DSC)和熱解重量分析(thermal gravimetric analysis，TGA)[11]。

1.3.5 北沙參多糖的生物活性

(1) DPPH自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[12]。

(2) OH自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[13]。

(3) 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制：取pH 6.81緩沖溶液3 mL 和2 mmol/L PNPG溶液0.8 mL，37 ℃孵育20 min，加入40 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液1 mL，繼續(xù)反應(yīng)20 min，加1.0 mol/L碳酸鈉1 mL終止反應(yīng)，紫外-可見分光光度計(jì)在400 nm測(cè)吸光度值，為對(duì)照組A1。將體系中1 mLα-葡萄糖苷酶換為1 mL蒸餾水，其余條件不變，測(cè)定吸光度值，為空白組A2。

取pH 6.81緩沖溶液2 mL、2 mmol/L PNPG 0.8 mL，分別加入1 mL濃度分別為8.0，4.0，2.0，1.0，0.5 mg/mL的多糖溶液，同上法進(jìn)行反應(yīng)，并測(cè)吸光度值，為樣品組A3。將體系中1 mLα-葡萄糖苷酶換為1 mL蒸餾水，其余條件不變，測(cè)定吸光度值，為樣品對(duì)照組A4[14]。阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照品。按式(1)計(jì)算抑制率。

(1)

式中：

R——抑制率，%；

A1——對(duì)照組的吸光度；

A2——空白組的吸光度；

A3——樣品組的吸光度；

A4——樣品對(duì)照組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 由圖1可知，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率先上升后又趨于平緩，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)20 min時(shí)，多糖的提取率不再發(fā)生明顯的變化。因在一定的時(shí)間內(nèi)，超聲波的空化作用可提高多糖的提取率，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)由于機(jī)械剪切作用和熱量聚集，降解多糖，從而使得多糖提取率不再增加，甚至降低。因此，選取20 min的超聲提取時(shí)間作為Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖1 提取時(shí)間對(duì)北沙參多糖提取率的影響

Figure 1 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide fromRadixGlehniae

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 由圖2可知，隨超聲提取溫度的增加，多糖提取率先上升后趨于平緩，這是由于升高溫度有助于傳質(zhì)過(guò)程的發(fā)生，可加劇分子擴(kuò)散，從而加快溶劑的滲透以及多糖類物質(zhì)的溶出。當(dāng)提取溫度超過(guò)60 ℃ 時(shí)提取率上升已不明顯，而且提取溫度過(guò)高會(huì)難以控制試驗(yàn)條件，浪費(fèi)資源，所以選取60 ℃提取溫度為后續(xù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.1.3 液料比對(duì)北沙參多糖提取率的影響 由圖3可知，多糖提取率隨提取液料比的增加而增加，當(dāng)液料比大于20∶1(mL/g)時(shí)，提取率趨于平緩。溶劑量的增加使得北沙參與提取溶液的接觸面積增大，溶劑傳質(zhì)推動(dòng)力增強(qiáng)，可使得多糖提取率和溶出速度增加。但溶劑體積過(guò)大可導(dǎo)致物料吸附溶劑的量也增大，多糖被物料吸附不易溶出。因此，選取20∶1 (mL/g)的液料比作為后續(xù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖2 提取溫度對(duì)北沙參多糖提取率的影響

Figure 2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide fromRadixGlehniae

圖3 液料比對(duì)北沙參多糖提取率的影響

2.2 北沙參多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn) 基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對(duì)北沙參多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提取溫度、提取時(shí)間、液料比為自變量，多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和原理，得出北沙參多糖提取率響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表(表1)。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

采用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)立17組試驗(yàn)，各因素和響應(yīng)面值(多糖提取率)如表2所示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，分析各因素的效應(yīng)，最后得到北沙參多糖提取最優(yōu)工藝。

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析 利用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，擬合得到北沙參多糖提取率的二次多元回歸方程為：

Y=11.76+0.62A+0.33B+0.25C+0.35AB+0.79AC-0.060BC-0.64A2-0.75B2-0.96C2。

(2)

表2 多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

Table 2 Response surface experimental design and result of polysaccharide extraction rate ofRadixGlehniae

試驗(yàn)號(hào)ABC提取率/%10-119.81200011.8731-1010.54411011.68510-19.576-1109.517-10-110.08800012.11910-19.691001-110.261100010.531200011.8713-1-109.78140-1-19.411500012.4416-1019.241701-110.35

2.2.3 響應(yīng)面分析 圖4～6是因素(提取溫度、提取時(shí)間、液料比)交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。由圖4可知，隨超聲提取溫度的升高，多糖提取率呈現(xiàn)先有所增加后緩慢降低的趨勢(shì)。超聲提取時(shí)間為15～25 min時(shí)，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；等值線區(qū)域水平，表示兩因素間具有顯著的交互作用。由圖5可知，隨提取溫度的升高，提取率呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)；隨液料比的加大，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由圖6可知，隨液料比的加大及超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

2.3 最佳工藝參數(shù)及驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)二次多項(xiàng)式回歸分析求最大值，得到超聲波輔助提取多糖的最佳工藝為：液料比22∶1 (mL/g)、超聲提取時(shí)間22.07 min、超聲提取溫度64.5 ℃，在此條件下，北沙參多糖提取率的理論預(yù)測(cè)值為12.17%，結(jié)合最優(yōu)工藝參數(shù)與實(shí)際生產(chǎn)可操作性，對(duì)各因素的取值進(jìn)行修正，最終確定超聲波輔助提取最優(yōu)工藝為：液料比22∶1 (mL/g)、超聲提取時(shí)間22 min、提取溫度65 ℃，經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，北沙參多糖平均提取率為12.13%，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明優(yōu)化工藝重復(fù)性良好，最優(yōu)工藝的結(jié)果可靠。

表3 北沙參多糖提取率回歸模型方差分析

Table 3 Analysis of extraction rate regression model variance ofRadixGlehniaepolysaccharide

方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性模型15.6491.745.090.021 7顯著A1.9211.925.610.049 7B0.5510.551.600.245 9C0.2110.210.600.462 8AB0.5010.501.460.266 9AC1.2111.213.540.101 9BC6.97E-0316.97E-030.020.890 5A21.4111.414.140.081 3B21.9511.955.710.048 2C21.8911.895.540.050 8殘差2.3970.34失擬項(xiàng)0.2610.260.720.427 3不顯著純誤差2.1360.36總回歸18.0316

2.4 紫外-可見光譜分析蛋白類成分

由圖7可知，北沙參多糖在280 nm處有一定的吸收峰，說(shuō)明其可能含有蛋白類成分，蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

圖4 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)北沙參多糖提取率的交互影響

圖5 提取溫度和液料比對(duì)北沙參多糖提取率的交互影響

圖6 提取時(shí)間和料液比對(duì)北沙參多糖提取率的交互影響

圖7 北沙參多糖紫外-可見光譜圖

2.5 北沙參多糖中蛋白質(zhì)含量

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為y=0.690 71x+1.103 5(R2=0.991)。經(jīng)計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量為1.22%。

2.6 北沙參多糖中總糖含量

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為b=9.1a+0.082 4(R2=0.998)。經(jīng)計(jì)算樣品中總糖含量為90.40%。

2.7 紅外光譜分析特征官能團(tuán)

從圖8可以看出，在1 021.28 cm-1處吸收峰是醇羥基的C—O伸縮振動(dòng)，1 155.97 cm-1處為環(huán)上C—O的振動(dòng)峰，1 638.05 cm-1附近為—OH的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 414.14 cm-1處為C—H鍵的彎曲振動(dòng)吸收峰，2 930.43 cm-1附近為多糖的C—H伸縮振動(dòng)吸收峰，3 409.19 cm-1附近為O—H的伸縮振動(dòng)峰，結(jié)果表明，樣品具有多糖類物質(zhì)典型特征峰[15-16]。

圖8 北沙參多糖紅外圖譜

2.8 羥基自由基清除能力

由圖9可知，隨著樣品濃度的升高，北沙參多糖對(duì)羥基自由基的清除作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)濃度為4.00 mg/mL時(shí)，北沙參多糖對(duì)羥基自由基的清除率為78.9%，北沙參多糖對(duì)羥基自由基的半數(shù)清除率濃度IC50值為1.71 mg/mL，但清除效果弱于對(duì)照品VC(IC50值為0.072 mg/mL)。

圖9 北沙參多糖和VC對(duì)羥基自由基的清除作用

Figure 9 The scavenging rates on hydroxyl radical ofRadixGlehniaepolysaccharide and VC

2.9 DPPH自由基清除能力

由圖10可知，隨著樣品濃度的升高，北沙參多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)濃度為4.00 mg/mL時(shí)，北沙參多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為70.2%，北沙參多糖對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率濃度IC50值為1.99 mg/mL，但清除效果弱于對(duì)照品VC(IC50值為0.005 mg/mL)。

圖10 北沙參多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除作用

Figure 10 The scavenging rates on DPPH radical ofRadixGlehniaepolysaccharide and VC

2.10 對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制

由圖11可知，北沙參多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，隨著濃度的升高，抑制作用也增強(qiáng)，整體呈線性關(guān)系。北沙參多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制率濃度IC50值為5.23 mg/mL。阿卡波糖的IC50值為0.501 mg/mL，對(duì)比可得，北沙參多糖低于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明北沙參多糖具有潛在的降血糖活性。

圖11 北沙參多糖與阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取北沙參多糖工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)北沙參多糖的抗氧化活性及降血糖活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明：北沙參多糖的最優(yōu)提取工藝為提取溫度65 ℃，提取時(shí)間22 min，液料比22∶1 (mL/g)，在此條件下多糖提取率為12.13%。最優(yōu)工藝條件下制備的北沙參多糖具有多糖的典型特征吸收峰，總糖含量為90.4%，蛋白質(zhì)含量為1.22%，熱降解溫度為300.32 ℃。北沙參多糖具有一定的清除羥基自由基和DPPH自由基的能力和潛在的降血糖活性(對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值為5.23 mg/mL)。

本試驗(yàn)僅在體外對(duì)北沙參多糖的活性進(jìn)行了測(cè)定，并未進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，后續(xù)將對(duì)北沙參多糖的體內(nèi)抗氧化及降血糖活性進(jìn)行研究。