但佳明，歐紅萍，嚴(yán)光文，田一男，魏 斌，涂 蕊，肖啟程，唐 麗，楊亭玉，彭廣能，王永剛，鐘志軍*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130； 3.西昌學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 西昌 615000； 4.北川羌族自治縣曲山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，四川 綿陽(yáng) 622750)

賈第蟲(chóng)(Giardiaduodenalis)又名藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)(Giardialamblia)、腸賈第蟲(chóng)(Giardiaintestinalis)，寄生于動(dòng)物腸道內(nèi)，主要通過(guò)飲水或食物傳播[1]，可感染人及某些哺乳動(dòng)物，引起患病動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀[2]，是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)[3]。因此，對(duì)賈第蟲(chóng)進(jìn)行流行情況調(diào)查與基因型研究越來(lái)越受到科學(xué)家的重視。賈第蟲(chóng)是一個(gè)復(fù)雜的集合體，目前已鑒定8個(gè)(A～H)不同的集聚體，各集聚體之間存在宿主特異性[4-5]。其中，集聚體A和B主要感染人和多種哺乳動(dòng)物，集聚體C和D主要在犬科動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，集聚體E主要感染偶蹄動(dòng)物，集聚體F主要感染貓科動(dòng)物，集聚體G和H分別在嚙齒類和海洋哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)[6]。引起人類賈第蟲(chóng)病的集聚體主要為集聚體A和B，近年來(lái)有研究[7-9]表明，聚集體C、D、E、F偶爾會(huì)在人中發(fā)現(xiàn)，并且包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了集聚體E感染[10]，提示上述集聚體也存在一定的人獸共患性。研究表明，奶牛以集聚體A、B、E為優(yōu)勢(shì)集聚體[11-12]，在我國(guó)東北、西北部分地區(qū)，奶牛以集聚體E為優(yōu)勢(shì)集聚體[13-14]，而在河南以集聚體A為優(yōu)勢(shì)集聚體[11]。奶牛作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在人類生產(chǎn)生活中占有重要地位，賈第蟲(chóng)感染攜帶不僅對(duì)奶牛養(yǎng)殖造成經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)人類健康也存在一定的威脅。其中，斷奶前犢牛由于其賈第蟲(chóng)感染率較高[11-12，15]，且集中排泄包囊，在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)方面越來(lái)越引起人們的注意[16]。本研究對(duì)四川部分地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查，經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增賈第蟲(chóng)β-giaidin(bg)、tpi和gdh基因序列，對(duì)陽(yáng)性樣品賈第蟲(chóng)集聚體進(jìn)行鑒定，為四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)流行情況以及流行集聚體種類研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(糞便DNA提取試劑盒)購(gòu)自美國(guó)OMEGA Bio-Tek公司；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 樣品采集

2016年6月至2017年3月在四川省10個(gè)地區(qū)11個(gè)奶牛場(chǎng)(成都、洪雅、阿壩、眉山、資陽(yáng)、安岳、邛崍、青白江、德陽(yáng)各1個(gè)奶牛場(chǎng)，綿陽(yáng)2個(gè)奶牛場(chǎng))采集1月齡內(nèi)斷奶前犢牛糞便共計(jì)278份，每份糞樣約50 g，置于潔凈的塑料采樣袋中，做好相應(yīng)標(biāo)記、編號(hào)，于4 ℃下保存待檢。

1.3 樣本DNA提取

采用改良飽和蔗糖溶液漂浮法處理糞便，得到含糞便及卵囊的沉淀物，按E.Z.N.A.?Stool DNA Kit說(shuō)明書(shū)步驟操作，提取的DNA 置-20 ℃環(huán)境保存。

1.4 PCR擴(kuò)增

基于β-賈第素(β-giaidin)基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件參照Sulaiman 等[17]報(bào)道?；讦?賈第素(β-giaidin)基因鑒定出的陽(yáng)性樣品，使用磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、谷氨酸脫氫酶(gdh)位點(diǎn)進(jìn)行基因亞型鑒定，引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件參照Appelbee等[18]和Caccio等[19]的報(bào)道。反應(yīng)體系均為25 μL，其中包括：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、去離子水8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL(第1輪PCR產(chǎn)物為第2輪模板)。通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第2套巢式PCR產(chǎn)物，放置于凝膠成像儀內(nèi)，使用Image Lab軟件成像拍照。

1.5 測(cè)序及分析

將PCR產(chǎn)物陽(yáng)性者送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中BLAST比對(duì)校正后提交至NCBI。將校正后序列與NCBI上參考序列使用Clustal X比對(duì)，使用MEGA 6的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，278份樣品中有26份樣品為賈第蟲(chóng)陽(yáng)性，總感染率為9.35%(26/278)。在10個(gè)采樣地區(qū)中，6個(gè)地點(diǎn)檢測(cè)出賈第蟲(chóng)感染陽(yáng)性，感染率在7.69%～46.43%之間?；赽g、tpi和gdh基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增26、24、24條序列。經(jīng)序列比對(duì)鑒定，均為集聚體E。將序列提交至NCBI獲得登錄號(hào)(MF671870-MF671908)。

2.2 基因序列分析

在NCBI中搜索bg、tpi和gdh相關(guān)參考序列，采用MEGA 6將參考序列與本次研究所得序列進(jìn)行同源性分析?；赽g基因位點(diǎn)(圖1)，26條序列形成7種基因亞型，其中4種基因亞型為已知亞型，其序列分別參考KT922247、KY769091、KY769093和KT698677。其余3種為新基因亞型，分別為E13(MF671880)、E14(MF671883)和E16(MF671886)。7種基因亞型中，以E1(n=8)基因亞型為主。

基于tpi基因位點(diǎn)(圖2)，24條序列形成7種基因亞型，其中5種基因亞型為已知亞型，序列參考為KT922261、KT922259、EF654690、KY432848和KY769103。其余2種為新基因亞型，分別為E21(MF671904)和E24(MF671907)。其中以E3(n=13)基因亞型為主。

?，本實(shí)驗(yàn)所得序列，下同。?，Sequence in this study. The same below.圖1 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)bg基因位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on bg gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

圖2 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng) tpi基因位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on tpi gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

基于gdh基因位點(diǎn)(圖3)，24條序列同樣形成7種基因亞型，其中5種為已知基因亞型，序列參考為KY769096、KT369780、KT368785、KT698971和KY432838。其余2種為新基因亞型：E18(MF671896)和E19(MF671899)。其中以E1(n=9)基因亞型為主。

本研究中，26份賈第蟲(chóng)陽(yáng)性樣品基于各基因位點(diǎn)均分別發(fā)現(xiàn)7種基因亞型，具體分型結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)gdh基因位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on gdh gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

3 討論

斷奶前犢奶牛賈第蟲(chóng)感染在我國(guó)各地區(qū)廣泛存在，具有較高的感染率。有研究表明，我國(guó)西北、中部、東北、東南部分地區(qū)感染率分別為9.7%(23/237)[20]、17.6%(89/505)[11]、13.3%(36/271)[14]、60.1%(492/818)[16]。而在西部地區(qū)，目前對(duì)四川地區(qū)暫未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，對(duì)四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況的調(diào)查，有利于了解四川地區(qū)奶牛賈第蟲(chóng)感染情況，同時(shí)也有利于研究賈第蟲(chóng)這類人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。本研究結(jié)果表明，四川部分地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)總感染率為9.35%(26/278)，較我國(guó)中部、東北、東南地區(qū)感染率低，與西北部分地區(qū)感染率接近，表明不同地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染率存在地區(qū)差異。本研究中，10個(gè)采樣地區(qū)有6個(gè)地區(qū)檢測(cè)出賈第蟲(chóng)陽(yáng)性(感染率0%～46.43%不等)，表明不同養(yǎng)殖場(chǎng)的感染率仍存在差異。其原因可能與每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)密度、管理方式等因素有關(guān)，且部分養(yǎng)殖場(chǎng)斷奶前犢牛通常未進(jìn)行分欄飼養(yǎng)，以群養(yǎng)為主，增加賈第蟲(chóng)在奶牛之間的傳染概率[16]。

目前國(guó)內(nèi)奶牛賈第蟲(chóng)感染主要以集聚體A和集聚體E為主，呈混合感染。根據(jù)不同的基因位點(diǎn)，檢測(cè)出的基因型可能不同，因此在對(duì)某一地區(qū)進(jìn)行賈第蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定時(shí)，常采用多位點(diǎn)基因鑒定以提高基因型鑒定、混合感染及序列多態(tài)性分析的準(zhǔn)確性[21]。目前，賈第蟲(chóng)蟲(chóng)種的鑒定常采用包括16S rRNA、tpi、gdh和β-giaidin等[22]。之前研究表明，我國(guó)河南省、東北地區(qū)、寧夏回族自治區(qū)奶牛感染賈第蟲(chóng)以集聚體E為主[12，15，23]，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有集聚體A[12，23]、集聚體B感染[12，15]和集聚體A/E混合感染[12]。本研究基于bg、tpi和gdh三個(gè)基因位點(diǎn)，對(duì)四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況進(jìn)行檢測(cè)，分別擴(kuò)增出26、24，24條序列 ，經(jīng)序列比對(duì)鑒定，均為集聚體E，分別以E1(n=8)、E3(n=13)，E1(n=9)基因亞型為主。提示四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)基因型與其他地區(qū)存在一定差異?；趖pi、gdh和β-giaidin基因位點(diǎn)均分別鑒定出7種亞型，并基于3種不同位點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)了7種新基因亞型，表明四川地區(qū)賈第蟲(chóng)蟲(chóng)種的遺傳多樣性較高，各基因位點(diǎn)序列差異較大。

本研究首次采用多位點(diǎn)基因序列分析法對(duì)四川部分地區(qū)犢牛賈第蟲(chóng)感染情況及基因分型進(jìn)行研究。四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)主要以集聚體E為主。本次試驗(yàn)雖然未檢測(cè)出人獸共患集聚體A和B，但6個(gè)地區(qū)均檢測(cè)出集聚體E，表明四川地區(qū)犢牛感染賈第蟲(chóng)形勢(shì)仍然嚴(yán)重。在今后日常生產(chǎn)管理中，仍需加強(qiáng)奶牛的飼養(yǎng)管理，定期驅(qū)蟲(chóng)，做好糞便處理工作，避免帶有感染性包囊的糞便污染水源及周邊環(huán)境。同時(shí)，應(yīng)繼續(xù)對(duì)四川地區(qū)犢牛賈第蟲(chóng)感染進(jìn)行長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)，以確保家畜以及人類的健康。