徐立新,張 偉,師忠芳,董麗萍,閆 旭,袁 芳

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床采用手術(shù)、放療和化療的綜合治療，有效化療是延長術(shù)后腦膠質(zhì)瘤患者生命的必要手段之一[1]。但由于血腦屏障和腫瘤耐藥現(xiàn)象的存在，化療藥物的療效仍然不盡如人意[2]，術(shù)后腦膠質(zhì)瘤患者選擇適合的化療藥物對(duì)提高療效、減輕不良反應(yīng)有重要意義。本研究用體外藥敏檢測(cè)法比較了腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本對(duì)臨床5種常用化療藥的敏感性，并分析了其與患者病理分級(jí)的相關(guān)性；電鏡觀察了膠質(zhì)瘤敏感藥物標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)，對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為術(shù)后膠質(zhì)瘤患者選擇合適的化療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 112例標(biāo)本選自2013-01至2015-12北京天壇醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織。男74例，女38例；年齡12～71歲，平均(42.95±11.79)歲；初發(fā)97例，復(fù)發(fā)15例。按照WHO腦膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)：Ⅱ級(jí)53例，Ⅲ級(jí)20例，Ⅳ級(jí)39例。

1.2 試劑 組織塊培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液?；熕幬锬崮就?ACNU)、順鉑(DDP)、替莫唑胺(TMZ)、長春新堿(VCR)、替尼泊甙(VM26)五種單獨(dú)用藥及DDP+VM26組合用藥，所試驗(yàn)藥物濃度均為血漿峰濃度，分別為0.7、0.25、0.5、2.0、0.05 mg/ml。

1.3 組織培養(yǎng)藥敏檢測(cè)法 根據(jù)文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。手術(shù)當(dāng)日取無污染組織標(biāo)本，切割成1 mm3大小的組織塊，放置于有濾紙的24孔培養(yǎng)板中，加入組織塊培養(yǎng)液300 μl，37 ℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。第2天用江蘇先聲藥業(yè)有限公司開發(fā)的TECIA(tissue culture-end point staining- computer image analysis, TECIA)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定組織塊面積(area, A)，然后除對(duì)照孔外，每孔加入化療藥物3 μl，112例標(biāo)本除觀察5種化療藥外，其中88例增加組合用藥DDP+VM26，在培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育72 h后，每孔組織塊上加10 μl MTT溶液(10 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h后用TECIA圖像分析系統(tǒng)測(cè)定組織藍(lán)染面積(blue area, BA)，TECIA分析軟件計(jì)算化療藥物抑制率(IR)，IR={1-[(BA處理/A處理)/(BA對(duì)照/A對(duì)照)]×100%。 對(duì)照為同一標(biāo)本未用化療藥物作用的腦膠質(zhì)瘤組織。參照Singh等[3]研究，以抑制率作為評(píng)價(jià)化療藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)，抑制率在30%以上為敏感，低于30%為耐藥。

1.4 透射電鏡觀察 選擇藥物抑制率較高的標(biāo)本，用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定2 h，再用1%鋨酸固定2 h，環(huán)氧丙烷置換后Epon812包埋，制備1 μm半薄切片，天青-美蘭染色后在光學(xué)顯微鏡下定位，制備40 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛染色，PHILIPS EM208s透射電鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件，腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本對(duì)化療藥敏感性比較、病理分級(jí)與各種藥物敏感性之間的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感性比較 112例標(biāo)本對(duì)化療藥物敏感性見表1。PDP+VM26敏感性最高，達(dá)40.9%。

2.2 透射電鏡觀察結(jié)果 為觀察化療藥物作用下腫瘤細(xì)胞變化，選擇對(duì)藥物敏感性較高的標(biāo)本，利用透射電鏡觀察腫瘤組織的超微結(jié)構(gòu)變化。 對(duì)照組可見腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，藥物組可見腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的凋亡晚期改變(如質(zhì)膜完整、細(xì)胞器密集、核染色質(zhì)斑塊狀凝聚、邊集、呈典型新月體樣)，或壞死改變(如裸核多見、質(zhì)膜崩解、細(xì)胞器溶解、核染色質(zhì)凝聚、溶解，圖1)。

表1 人腦膠質(zhì)瘤組織對(duì)化療藥物敏感性的比較

注：χ2=49.740,P<0.001；ACNU，尼莫司?。籇DP，順鉑； VCR，長春新堿；TMZ，替莫唑胺；VM26，替尼泊甙

圖1 透射電鏡替尼泊甙與順鉑組合用藥作用后腦膠質(zhì)瘤組織的超微結(jié)構(gòu)變化

A.對(duì)照組為未用化療藥物作用的腦膠質(zhì)瘤組織，腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常(×8000)；B.藥物組腫瘤細(xì)胞呈壞死改變(×10000)；C.藥物組腫瘤細(xì)胞呈凋亡晚期改變(×6000)；D.藥物組凋亡腫瘤細(xì)胞，核染色質(zhì)呈典型新月體樣凝聚(×16000)

2.3 病理分級(jí)與化療藥敏感性的關(guān)系 將112例患者按WHO膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行惡性度分級(jí)，并與各種藥物的敏感性進(jìn)行比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，只有DDP+VM26組合用藥的敏感性與患者的病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，其他五種單藥敏感性與患者的病理分級(jí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞病理分級(jí)與各種藥物敏感性的關(guān)系

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，惡性程度高，臨床影像學(xué)缺乏特異性[4]，治療強(qiáng)調(diào)以手術(shù)、放療、化療為主的綜合治療，其中化療是腦膠質(zhì)瘤治療的重要環(huán)節(jié)[5]。然而，由于腫瘤的異質(zhì)性及不同腫瘤類型或同一腫瘤類型的不同個(gè)體對(duì)化療藥物藥敏性不同，自20世紀(jì)60年代用化療藥治療腦膠質(zhì)瘤以來，治療效果不盡人意。因此，了解不同患者對(duì)不同化療藥物的敏感和耐受情況，為臨床選擇適合的化療藥有一定的指導(dǎo)意義。

本研究中組織培養(yǎng)藥敏檢測(cè)法參照立體組織培養(yǎng)法(histoculture drug response assay, HDRA)[6]，利用TECIA圖像分析系統(tǒng)，檢測(cè)了112例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本對(duì)臨床使用的治療惡性腦腫瘤的5種化療藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)對(duì)同一藥物不同患者間敏感性差異較大，同一個(gè)體對(duì)不同藥物的敏感性也存在差異，結(jié)果顯示各種化療藥物敏感比例的大小依次為DDP+VM 26、VM26、TMZ、VCR、DDP和ACNU。這與國內(nèi)學(xué)者利用單細(xì)胞的MTT法進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤體外藥敏檢測(cè)的結(jié)果相似[7]，張?bào)@宇等[8]應(yīng)用CCK-8法進(jìn)行化療藥物的敏感性測(cè)定也得到了相似的結(jié)果，表明該實(shí)驗(yàn)方法具有一定的穩(wěn)定性和重復(fù)性。本研究對(duì)患者病理分級(jí)是否影響藥物敏感性進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示只有DDP+VM26組合用藥的敏感性與患者的病理分級(jí)有關(guān)，這與張偉等[2]研究結(jié)果一致，以上結(jié)果提示對(duì)膠質(zhì)瘤患者實(shí)施個(gè)體化治療是非常必要的。

大量研究顯示，化療藥物之所以能達(dá)到抗腦膠質(zhì)瘤的作用，主要是通過直接或間接破壞DNA、抑制蛋白質(zhì)合成等不同機(jī)制發(fā)揮作用[9]，在本研究中筆者通過透射電鏡觀察各種化療藥物作用后膠質(zhì)瘤組織的超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，而給藥組腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的凋亡或壞死改變，表明化療藥物可能是通過引起腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死發(fā)揮抑瘤作用。徐榮等[10]通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法證實(shí)VM26在膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療過程中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果顯著。除了細(xì)胞凋亡和壞死，化療藥物作用后細(xì)胞是否存在其他的死亡方式，例如脹亡、自噬、焦亡等形式，值得我們進(jìn)一步深入研究。

研究結(jié)果顯示，VM26抑瘤作用較強(qiáng)。李巖等[11]研究發(fā)現(xiàn)VM-26聯(lián)合DDP對(duì)復(fù)發(fā)高級(jí)別膠質(zhì)瘤，無論耐藥基因O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methyl-guanine DNA methyltransferase, MGMT)啟動(dòng)子是否甲基化均有較好的療效，曹廣輝等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用VM26聯(lián)合甲基環(huán)亞硝脲聯(lián)合化療，能有效地控制手術(shù)切除和放療后MGMT陽性的對(duì)TMZ耐藥的低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的腫瘤生長，在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)DDP+VM26組合用藥的敏感性較高，這些研究結(jié)果為腦膠質(zhì)瘤患者的化療提供了新的選擇。

本研究結(jié)果充分說明腦膠質(zhì)瘤患者對(duì)不同化療藥物的敏感性存在明顯的個(gè)體差異, 同一種藥物對(duì)不同腦膠質(zhì)瘤患者作用也存在差異。研究結(jié)果提示化療前對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行個(gè)體化化療敏感性試驗(yàn)是必要的, 可以避免盲目用藥, 提高治療效果。近些年來出現(xiàn)的分子病理檢測(cè)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者的化療也提供了一定幫助，如果能把體外藥敏檢測(cè)和分子病理檢測(cè)結(jié)合起來，可能會(huì)對(duì)膠質(zhì)瘤患者化療有更大幫助。