唐 榕,寧恩創(chuàng),林 瑩

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

桑葚為桑科桑屬(MorusalbaL.)的聚花果,在廣西分布廣泛、資源豐富[1]。桑葚果成熟期為4～6月份,味酸甜可口,其富含花色苷[2]?；ㄉ詹粌H是桑葚重要的活性物質(zhì)之一,也是桑葚主要的呈色物質(zhì),它使桑葚色澤表現(xiàn)為紫紅色或紫黑色[3]。作為天然色素,花色苷安全無毒,并且具有抗氧化、抗癌、緩解視疲勞等功效[4-5],在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景?；ㄉ兆鳛樯］刂兄饕钚砸蜃?在食品加工中易降解和損失,導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)降低。因此,研究桑葚花色苷適宜的加工與貯藏條件,對其最終能否得到有效利用至關(guān)重要。朱慶珍等[6]、姜少娟[7]僅對桑葚色素粗提物進行了穩(wěn)定性研究,而本研究先對桑葚花色苷純化,再研究其穩(wěn)定性,能更近于真實的了解溫度、pH、光照等加工條件對花色苷的影響。

本文擬通過單因素實驗探明桑葚花色苷提取的適宜條件,以大孔樹脂為填料,通過柱層析對提取液進行純化,確定花色苷適宜的加工與貯存條件,為桑葚花色苷的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚 -18 ℃冷凍保存,市售;大孔樹脂HPD600、D101、LX1180、AB-8、DA201-C 陜西樂博生化科技有限公司;無水乙醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉等 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;乙腈、甲酸、甲醇 色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準品 HPLC≥98%,北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

UV-6100紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Beta 2-8 LSCplus實驗室冷凍干燥機 德國CHRIST公司;CM-3600d色差計 柯尼美能達有限公司;HL-2B數(shù)顯恒流泵、BSZ-160F電腦自動部分收集器 上海精科實業(yè)有限公司;Agilent 1200 HPLC色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葚花色苷提取條件的確定 桑葚于4 ℃解凍,打漿,參照文獻[7,10-11]確定料液比為1∶10。乙醇濃度的確定:取5 g桑葚漿,按料液比加入不同濃度(30%～80%)的酸化乙醇溶液(含0.1% HCl),超聲功率150 W,提取1 h,抽濾,計算花色苷得率,確定最佳乙醇濃度;超聲時間的確定:取5 g桑葚漿,按料液比(1∶10)加入40%酸化乙醇溶液,在不同的超聲時間(30～110 min)下進行提取,抽濾,計算花色苷得率,確定最佳超聲時間。

1.2.2 桑葚花色苷的純化

1.2.2.1 樹脂篩選 于510 nm下測定花色苷粗提液吸光值A(chǔ)0。分別準確稱取活化后的HPD600、D101、LX1180、AB-8、DA201-C大孔樹脂濕態(tài)體積5 g,加入同濃度的花色苷粗提液60 mL,在100 r/min的轉(zhuǎn)速下25 ℃振蕩24 h,充分吸附后,過濾,測濾液吸光值A(chǔ)1。將濾出的樹脂加入到60 mL 60%乙醇溶液(HCl調(diào)至pH3),在100 r/min的轉(zhuǎn)速下室溫振蕩24 h,充分解吸后過濾,測濾液吸光值A(chǔ)2。以吸附率及解吸率為指標(biāo),篩選出對桑葚花色苷的吸附及解吸性能均較好的樹脂。

吸附率(%)=(A0-A1)/A0×100

解吸率(%)=A2/(A0-A1)×100

1.2.2.2 靜態(tài)吸附/解吸曲線 稱取活化后的大孔樹脂5 g于三角瓶中,加入60 mL 0.1 mg/mL的桑葚花色苷粗提液,25 ℃、100 r/min振蕩,每隔一段時間測定花色苷含量,對時間作圖,繪制靜態(tài)吸附曲線;將濾出的樹脂,加入60 mL 60%乙醇溶液(pH3),25 ℃、100 r/min振蕩,每隔一段時間測定花色苷含量,對時間作圖,繪制靜態(tài)解吸曲線。

1.2.2.3 純化方法 以1.2.2.1中篩選出的樹脂為填料。提取液經(jīng)8000 r/min離心10 min、抽濾、過0.22 μm濾膜,稀釋上樣液花色苷溶液濃度至0.1028 mg/mL,通過恒流泵以1 mL/min的速率上樣,用部分收集器每10 min收集一次流份,以管數(shù)為橫坐標(biāo),流出液中花色苷含量為縱坐標(biāo),繪制動態(tài)泄露曲線。

先以水洗脫糖分等雜質(zhì),再用60%乙醇溶液(pH2)洗脫色素溶液,洗脫流速1 mL/min,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),流出液中花色苷含量為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)洗脫曲線。洗脫液經(jīng)45 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后進行真空冷凍干燥(凍干溫度25 ℃),備用。

1.2.2.4 高效液相色譜條件 樣品及標(biāo)準品用50%甲醇(含0.1% HCl)溶解;色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18;流動相:A液為乙腈,B液為10%的甲酸水溶液,線性梯度洗脫:0～15 min,A液由5%升至15%;15～21 min,A液由15%升至28%;21～22 min,A液由28%升至40%,流速1 mL/min,檢測波長520 nm,進樣體積20 μL。

1.2.3 純化后桑葚花色苷穩(wěn)定性研究

1.2.3.1 溫度對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 將花色苷溶液分別置于25、50、70、90 ℃下,于1、2、3、4 h測定提取液顏色、花色苷保存率。

1.2.3.2 光照對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 將花色苷溶液分別置于室內(nèi)光(50～100 Lux)、室外光(5萬～6萬 Lux)及避光條件下,每天測定提取液顏色、花色苷保存率。

1.2.3.3 pH對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 將花色苷溶液分別用pH3～6的緩沖液稀釋15倍,以蒸餾水稀釋的溶液作為對照組。取稀釋后的溶液50 mL置于避光條件下,3 d后測定提取液顏色、花色苷保存率。

1.2.3.4 金屬離子對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 將Na+、Mg2+、Al3+、Cu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+分別加入到花色苷溶液中,使各金屬離子終濃度為5 mmol/L。避光放置,每天測定提取液顏色、花色苷保存率。

1.2.4 測定方法 總花色苷的測定:采用pH示差法[8]。將1 mL待測液分別加入9 mL pH1.0和pH4.5的緩沖液,分別在510 nm和720 nm下測定吸光度;

花色苷得率(mg/g)=提取液中花色苷質(zhì)量(mg)/稱取的桑葚質(zhì)量(g);

花色苷保存率(%)=C/C0×100

式中,C為處理后花色苷含量(mg/mL),C0為初始含量(mg/mL)。

式中,Δa為處理后樣品與初始樣品的紅綠值之差;Δb為處理后樣品與初始樣品的黃藍值之差;ΔL為處理后樣品與初始樣品的亮度值之差。

色價測定參考胡金奎[10]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)3個平行,采用Origin 8.6和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用ANOVA中的Duncan分析差異性,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚花色苷提取條件的確定

2.1.1 乙醇濃度的確定 花色苷類通常帶有若干未被取代的羥基或糖基,是一種極性化合物。又因為花色苷在中性和堿性條件下不穩(wěn)定,所以目前一般采用鹽酸化的醇作為提取液。

2.1.2 超聲時間的確定 超聲波可產(chǎn)生空化效應(yīng)和局部高溫,使細胞破裂而促進花色苷的溶出。圖2結(jié)果顯示,超聲時間小于90 min時,隨著超聲時間的增加,花色苷得率增高。但當(dāng)超聲時間大于90 min時,花色苷得率反而下降,這可能是由于超聲時間過長對一些花色苷造成了破壞。因此,超聲時間選擇90 min。

圖2 超聲時間對桑葚花色苷得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extraction yield of anthocyanin

綜上,確定桑葚花色苷的提取條件為:40%乙醇溶液(含0.1% HCl),料液比1∶10,超聲提取90 min,得率(2.9±0.1) mg/g。抽濾后40 ℃下真空濃縮,4 ℃冷藏備用。

2.2 桑葚花色苷的純化

2.2.1 大孔樹脂的篩選 不同樹脂的靜態(tài)實驗結(jié)果比較見表1,大孔樹脂是物理性吸附,主要影響其性能的指標(biāo)是極性和比表面積。綜合吸附和解吸效果來看,HDP600 表現(xiàn)較好,是用于純化桑葚花色苷較理想的樹脂。

表1 不同大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能Table 1 Static adsorption and desorption properties of different macroporous resin

圖1 乙醇濃度對桑葚花色苷得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction yield of anthocyanin

2.2.2 HDP600的靜態(tài)吸附/解吸曲線 圖3顯示,HPD600對桑葚花色苷的吸附、解吸屬于快速平衡型。在吸附和解吸過程的前30 min花色苷含量變化最大,隨后變化逐漸放緩。吸附在120 min左右達到平衡,解吸在90 min左右即達到平衡。

圖3 HDP600靜態(tài)吸附/解吸曲線Fig.3 Static adsorption/desorption curve of HPD600

2.2.3 動態(tài)泄露曲線 上樣初期,花色苷在大孔樹脂表面充分進行擴散,花色苷充分被樹脂吸附,因此流出液中未檢測到花色苷。隨著上樣量的增多,部分樹脂逐漸吸附飽和,吸附力減弱,未被吸附的少量花色苷隨著洗脫液流出。當(dāng)樹脂完全吸附飽和時,花色苷類物質(zhì)透過樹脂,流出液中花色苷含量急劇增大,此時大孔樹脂無法吸附更多的花色苷,即大孔樹脂的吸附達到泄漏點,應(yīng)停止上樣。因此,在1 mL/min的上樣流速下,每1 mL濕樹脂可以處理33.17 mL濃度為0.1028 mg/mL的花色苷溶液。

圖4 HDP600吸附桑葚花色苷的動態(tài)泄露曲線Fig.4 Dynamic leakage curve of HPD600 adsorbed anthocyanin

2.2.4 動態(tài)洗脫曲線 由圖5可以看出,洗脫峰較為明顯,說明洗脫物質(zhì)較為集中,有利于隨后的濃縮。當(dāng)洗脫液用量為105管(1050 mL)時,即約5倍柱體積,花色苷基本洗脫完畢,此后流出液中雖然殘留有花色苷,但含量較少,就效益考慮,可以放棄收集剩下的洗脫液。

圖5 HDP600的動態(tài)洗脫曲線Fig.5 Dynamic elution curve of HPD600

2.2.5 純化后桑葚花色苷的液相色譜圖 純化后樣品的第二個峰出峰時間為8.394 min,與標(biāo)準品的出峰時間8.296 min接近。將標(biāo)準品加入樣品后,第二個峰出峰時間為8.270 min,且峰面積所占比例明顯增大。由此可以推測,樹脂純化后樣品中第二個峰為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。B中第二個峰面積為41.2%,可推測純化后樣品中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對含量為41.2%左右。

圖6 高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatography注:檢測波長520 nm,A:矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準品,B:樹脂純化后樣品,C:加標(biāo)樣品。

2.2.6 純化前后產(chǎn)品比較 由表2可以看出,樹脂純化后,產(chǎn)品色價、總花色苷含量均有所提高,除糖率67.6%,由于糖分的減少,使得產(chǎn)品呈干燥粉末狀,更易于保存。趙云霞[13]采用D101樹脂對桑葚色素進行純化,色價是未純化的4.39倍,除糖率為39.5%,前者高于本文測定值,但后者低于本文測定值。

表2 純化前后產(chǎn)品比較Table 2 Comparison of products before and after purification

2.3 穩(wěn)定性實驗

2.3.1 溫度對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 花色苷的穩(wěn)定性明顯受到溫度影響,如圖7所示,隨著溫度的升高,桑葚花色苷的保存率降低、色差變化程度加劇。Laleh等[14]研究不同溫度下血紅小檗等四種漿果花色苷的降解情況,推測可能是由于高溫下花色苷C3位上糖基發(fā)生水解,導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。此外,溫度增加時,花色苷的構(gòu)型會向查耳酮式轉(zhuǎn)換[12],從而導(dǎo)致溶液變色。在25 ℃下放置4 h,花色苷含量無顯著性差異(p>0.05),表明花色苷可以在25 ℃下放置。高溫、長時間加熱會加速花色苷的降解,因此,花色苷的保存與加工應(yīng)盡量在較低溫度下、較短時間內(nèi)進行。

圖7 溫度對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the stability of mulberry anthocyanin

2.3.2 光照對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 如圖8所示,室外光下(5～6萬Lux)花色苷的穩(wěn)定性明顯變差,與室內(nèi)光(50～100 Lux)和避光(0 Lux)相比,室外光下保存率急劇下降,總色差變化急劇上升。4 d后室外光下桑葚花色苷的保存率低于60%。避光和室內(nèi)光條件下花色苷保存率的變化無顯著性差異,室內(nèi)光的色差變化稍大于避光。尤揚等[15]的研究顯示,碧桃花色苷的光穩(wěn)定性好,在室外自然光和黑暗條件下無顯著性差異。這表明不同來源的花色苷其單體種類和比例不同,因此對光的穩(wěn)定性可能存在一定的差異。本研究結(jié)果提示,桑葚花色苷需避免暴露在室外強光下,應(yīng)在室內(nèi)光及避光條件下進行貯存與加工。

圖8 光照對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of light on the stability of mulberry anthocyanin

2.3.3 pH對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 在不同的酸堿條件下,花色苷4種構(gòu)型的比例會發(fā)生變化,從而導(dǎo)致色澤和顏色強度的改變,甚至造成花色苷的降解。如圖9所示,在25 ℃下放置3 d后,隨著pH的增大(對照組pH為2左右),花色苷的保存率顯著降低,色差變化加劇。李楊等[16]研究也表明,葡萄皮花色苷在常溫下放置30 h,隨著pH由2上升到6,保留率由90%下降到75%。因此,在貯存與加工時,應(yīng)使花色苷溶液維持在盡可能高的酸性條件下。

圖9 酸堿度對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on the stability of mulberry anthocyanin

2.3.4 金屬離子對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響 不同金屬離子對桑葚花色苷的影響不同。如圖10所示,Na+、Mg2+、Al3+對花色苷的穩(wěn)定性影響不大,而加入Cu2+和鐵離子的花色苷溶液保存率降低,溶液色澤變化大,尤其是Fe3+對桑葚花色苷的破壞程度最大,且隨著時間的增加,Fe2+被氧化成Fe3+,加入Fe2+的花色苷溶液變化趨勢接近Fe3+。張志博等[17]的研究也表明,Fe3+、Cu2+對越橘花色苷的穩(wěn)定性影響較大,并推測可能是花色苷中的酚羥基結(jié)構(gòu)與 Fe3+、Cu2+發(fā)生反應(yīng)生成沉淀,使其穩(wěn)定性降低。但王露等[18]研究發(fā)現(xiàn),Fe3+對紅肉桃花色苷的穩(wěn)定性有顯著的保護作用。這表明金屬離子對不同花色苷穩(wěn)定性的影響不同。對桑葚花色苷而言,應(yīng)盡可能避免使用銅、鐵容器進行加工與貯存。

圖10 金屬離子對桑葚花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of metal ions on the stability of mulberry anthocyanin

3 結(jié)論

桑葚花色苷提取的適宜條件為:提取液為40%乙醇溶液(含0.1% HCl),料液比1∶10,超聲時間90 min,在此條件下花色苷得率為2.9 mg/g。從5種不同樹脂中篩選出HPD600樹脂作為純化填料,純化后得到的產(chǎn)品為紫黑色粉末,色價為46.1,除糖率為67.6%,總花色苷含量為16.7%,采用高效液相分析出樹脂純化后的樣品中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對含量為41.2%左右。穩(wěn)定性實驗表明,溫度、光照、pH、金屬離子均會影響花色苷的保存率及色澤變化程度,高溫、室外光(5～6萬Lux)、偏堿性條件、銅離子和鐵離子均會降低桑葚花色苷的穩(wěn)定性。因此,桑葚花色苷的貯存與加工應(yīng)在低溫、避光、低pH條件下進行,并且應(yīng)避免接觸銅離子、鐵離子。