楊亞兵，劉梅林

（1．北京市仁和醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 102600；2．北京大學(xué)第一醫(yī)院老年科，北京 100034）

巨噬細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥因子分泌及組織因子（TF）的表達(dá)，形成泡沫細(xì)胞，在動(dòng)脈粥硬化性疾病中起著重要作用[1]。血脂康是特制紅曲，含有洛伐他汀及其同系物，同時(shí)還富含有不飽和脂肪酸、黃酮類物質(zhì)、麥角甾醇、生物堿等多種生物活性物質(zhì)[2]。大規(guī)模的臨床試驗(yàn)中國(guó)冠心病二級(jí)預(yù)防研究（China coronary secondary prevention study CCSPS）證實(shí)，血脂康能顯著降低冠心病患者非致死性心肌梗死及冠心病死亡的發(fā)生率，減少對(duì)PCI和（或）CABG的需求，同時(shí)減少腫瘤死亡和各種原因的總死亡[3]。與4S、CARE和LIPID 等國(guó)外的冠心病二級(jí)預(yù)防試驗(yàn)相比，CCSPS雖然TC和LDL-C降低的幅度較小，但在降低總死亡率、冠心病事件的發(fā)生率以及減少對(duì)PCI和CABG需求方面的療效有明顯優(yōu)勢(shì)，提示血脂康具有獨(dú)立于降脂的心血管保護(hù)作用[3]。大量的研究表明，血脂康還具有抗炎、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮功能、改善斑塊穩(wěn)定性等心血管保護(hù)作用。然而血脂康是否對(duì)巨噬細(xì)胞MDA含量、SOD活性、組織因子表達(dá)及P65表達(dá)和轉(zhuǎn)位的影響及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥物

氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）由北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供；血脂康原粉由北大維信公司提供；洛伐他?。⊿igma公司 美國(guó)）；特級(jí)胎牛血清（Gibico公司 美國(guó)）；MTT試劑盒（南京凱基生物有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RPMI 1640（Hyclone公司 美國(guó)）；0.25%胰蛋白酶（南京凱基生物有限公司）；DMSO（Sigma公司 美國(guó)）；FITC標(biāo)記的兔二抗（Santa Cruz公司）；青霉素、鏈霉素雙抗（南京凱基生物有限公司）；山羊血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；TF Rabbit Polyclonal Antibody（Santa Cruz，American）；P65 abbit Polyclonal Antibody（Santa Cruz，American）；β-actin Mouse Monoclonal Antibody（Santa Cruz，American）。

1.2 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞株（RAW264.7）由南京凱基生物有限公司提供。

1.3 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本ESPEC 公司）；IMT212倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）； BH22型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)（北京嘉創(chuàng)博遠(yuǎn)凈化科技有限公司）；UNICO2100UV紫外/可見光分光光度計(jì)（上海尤尼科儀器有限公司）；電熱恒溫水浴箱（上海尤尼科儀器有限公司）；電熱恒溫水浴箱（北京邁瑞達(dá)科技有限公司）。

Olympus FV 1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 方法

1.4.1 RAW264.7 P65細(xì)胞的培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24～28 h換培養(yǎng)液一次，48～72 h傳代。待巨噬細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且形成致密融合單層后分組處理以備實(shí)驗(yàn)使用。并使用MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)細(xì)胞存活率沒有影響。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)共分6個(gè)組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔：（1）空白組（control），RPMI1640培養(yǎng)液（2）ox-LDL組，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入50 μg/mlox-LDL；（3）洛伐他汀組（L），細(xì)胞培養(yǎng)液中加入50 μg/ml ox-LDL及10 μmol/ml洛伐他?。唬?）血脂康低劑量組（XZK25），細(xì)胞培養(yǎng)液中加入50 μg/ml ox-LDL 及25 μg/ml血脂康；（5）血脂康中劑量組（XZK50），細(xì)胞培養(yǎng)液中加入50 μg/ml ox-LDL 及50 μg/ml血脂康；（6）血脂康高劑量組（XZK100），細(xì)胞培養(yǎng)液中加入50 μg/ml ox-LDL 及100 μg/ml血脂康。各組均孵育48小時(shí)。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清MDA及SOD活性檢測(cè)

各組細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-70℃保存。根據(jù)試劑盒的說明，檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA含量和SOD活性。

1.4.4 western blot 檢測(cè)TF表達(dá)

各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌3次，加入懸浮細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置于冰上20 min厚，于4℃，13000 g離心20 min，小心吸出上清液，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，100 μg蛋白/泳道加入等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，混勻，煮沸5～10 min使蛋白變性，趁熱12000 rpm離心5 min，然后按預(yù)定順序加樣。80 V積層膠，120 V分離膠，電泳分離蛋白質(zhì)，200 mA 2 h轉(zhuǎn)膜.5%脫脂奶粉封閉4 h，加入一抗，4℃ 8 h，PBST洗膜3次，每次15 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，PBST洗膜3次，每次15 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（ECL）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光后條帶放入Alpha ImagerTM 2200圖像分析處理系統(tǒng)，利用Alpha Ease 40分析軟件，電腦直接掃描測(cè)定顯影條帶積分光密度值，條帶的積分光密度值（IDV）即表示蛋白的表達(dá)量，計(jì)算每份樣本中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量（TF/β-actin）。

1.4.5 免疫熒光檢測(cè)P65表達(dá)以及其細(xì)胞核轉(zhuǎn)位情況

將細(xì)胞傳至預(yù)先放入蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，棄培養(yǎng)液上清，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30分鐘，用PBS洗3次，每次5分鐘，再用3% H2O237℃孵育30分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，山羊血清37℃封閉30分鐘，加入P65一抗（1:50），4℃孵育過夜，加入FITC標(biāo)記的兔二抗（1:50）室溫暗盒內(nèi)孵育2小時(shí)，用PBS洗3次每次3分鐘，然后滴加PI染料，室溫孵育5分鐘后再用PBS洗3次每次3 min，立即激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊時(shí)組間差異采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較；方差不齊時(shí)組間差異采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各種藥物干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清MDA水平和SOD活性的影響

2.1.1 各組細(xì)胞MDA水平的影響

與空白對(duì)照組比較，o x-L D L刺激可顯著增加RAW264.7培養(yǎng)上清中MDA水平（P＜0.05）。洛伐他汀和血脂康均可降低RAW264.7培養(yǎng)上清中MDA水平（P＜0.05）。血脂康對(duì)上清中MDA的抑制呈明顯的劑量依賴性。低劑量血脂康對(duì)上清中MDA的抑制作用弱于洛伐他?。≒＜0.05），中劑量和高劑量對(duì)MDA的抑制作用均強(qiáng)于于洛伐他?。≒＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各種藥物干預(yù)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7培養(yǎng)上清中MDA的影響

與對(duì)照相比，*P＜0.05；與模型組相比，**P＜0.05；與洛伐他汀組相比，***P＜0.05。

2.1.2 各組細(xì)胞SOD活性的的影響

與空白對(duì)照組比較，ox-LDL可顯著抑制RAW264.7培養(yǎng)上清中SOD活性（P＜0.05）。洛伐他汀和血脂康均可升高RAW264.7培養(yǎng)上清中SOD活性（P＜0.05）。血脂康增加細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD活性的的作用呈明顯的劑量依賴性。低劑量和中劑量血脂康對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD活性的增加作用與洛伐他汀組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量血脂康對(duì)SOD活性的增加作用強(qiáng)于于洛伐他汀（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 各種藥物干預(yù)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7培養(yǎng)上清中SOD活性的影響

與對(duì)照相比，*P＜0.05；與模型組相比，**P＜0.05；與洛伐他汀組相比，***P＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞TF表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，o x-L D L刺激可顯著增加RAW264.7細(xì)胞TF表達(dá)（P＜0.05）。低劑量和中劑量血脂康及洛伐他汀對(duì)RAW264.7細(xì)胞TF的表達(dá)無明顯作用。高劑量血脂康可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的TF表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 各種藥物干預(yù)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7組織因子表達(dá)的影響

與對(duì)照相比，*P＜0.05；與模型組相比，**P＜0.05；與洛伐他汀組相比，***P＜0.05。

2.3 免疫熒光檢測(cè)各組藥物對(duì)P65表達(dá)及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響

免疫熒光檢測(cè)各種藥物對(duì)P65表達(dá)影響的結(jié)果并采用圖像分析軟件對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞核P65表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見圖4。與空白對(duì)照組比較，ox-LDL刺激可顯著增加P65在RAW264.7細(xì)胞以及細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)（P＜0.05）。洛伐他汀和血脂康均可降低P65在RAW264.7細(xì)胞以及細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)（P＜0.05）。血脂康對(duì)P65在RAW264.7細(xì)胞以及細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴性。低劑量血脂康對(duì)P65在RAW264.7細(xì)胞以及細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)抑制作用弱于洛伐他?。≒＜0.05），中劑量和高劑量對(duì)P65在RAW264.7細(xì)胞以及細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)抑制作用均強(qiáng)于于洛伐他?。≒＜0.05）。

圖4 各種藥物干預(yù)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7 P65表達(dá)的影響。A P65在全細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；BP65在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)情況。

與對(duì)照相比，*P＜0.05； 與模型組相比，**P＜0.05；與洛伐他汀組相比，***P＜0.05。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的組織因子（TF）主要來源于巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。巨噬細(xì)胞可攝取脂蛋白，使脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚集，形成泡沫細(xì)胞，釋放各種生物活性物質(zhì)，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[4]。斑塊破裂導(dǎo)致富含有組織因子的巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞以及其壞死凋亡形成的微粒暴露于血流，激活凝血途徑，形成血管內(nèi)血栓[4]。

本課題用ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7，模擬體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，探討血脂康對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)TF表達(dá)的影響以及相關(guān)機(jī)制。在本研究中，通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA含量和SOD活性評(píng)價(jià)細(xì)胞的氧化狀態(tài)。MDA是脂質(zhì)過氧的產(chǎn)物，是公認(rèn)的脂質(zhì)過氧化損傷的標(biāo)志。SOD是體內(nèi)重要要的抗氧化酶，參與體內(nèi)活性氧的清除。ox-LDL刺激使巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)上清中MDA含量增加，SOD活性降低，提示細(xì)胞氧化損傷增加。血脂康可明顯降低巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MDA含量，增加其SOD活性，并呈劑量依賴性。血脂康對(duì)氧化損傷的改善作用強(qiáng)于洛伐他汀，推測(cè)與其含有不飽和脂肪酸、黃酮類物質(zhì)、麥角甾醇、生物堿等活性物質(zhì)有關(guān)。

ox-LDL刺激使巨噬細(xì)胞RAW264.7TF表達(dá)明顯增加，血脂康下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的TF表達(dá)增加。血脂康對(duì)TF表達(dá)的抑制作用成劑量依賴性，并強(qiáng)于洛伐他汀。文獻(xiàn)報(bào)道，TF的表達(dá)與NF-κB、AP-1和Egr-1等轉(zhuǎn)錄因子的活性有關(guān)。NF-κB是由Rel蛋白家族中的兩個(gè)成員構(gòu)成的二聚體復(fù)合物，在TF表達(dá)調(diào)控中其重要作用。Rel蛋白的成員有：p65（RelA）、c-Rel、RelB、p50、p52等[5]。其中，c-Rel/P65是調(diào)控組織因子表達(dá)的主要NF-ΚB亞型。靜息狀態(tài)下，c-Rel/P65通常與NF-κB抑制蛋白單體（IκB）結(jié)合，以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)。在受到等刺激時(shí)，IκB迅速發(fā)生磷酸化，IκB與c-Rel/P65分離，c-Rel/P65移位于核內(nèi)，與目的基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上特定的KB位點(diǎn)特異性結(jié)合，啟動(dòng)和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[6]。本課題用免疫熒光檢測(cè)P65在巨噬細(xì)胞RAW264.7的表達(dá)以及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的情況，探討NF-κB在組織因子表達(dá)調(diào)控中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血脂康明顯抑制P65的表達(dá)以及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，提示血脂康具有抑制NF-κB激活的作用。活性氧（ROS）生成過多可以導(dǎo)致NF- κB激活，血脂康抑制NF-κB激活與其抗氧化作用密切相關(guān)。與洛伐他汀相比，血脂康抑制P65的表達(dá)以及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位作用更強(qiáng)。

小結(jié)，洛伐他汀相比，血脂康抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7 TF表達(dá)作用更顯著，與其具有更好的抗氧化，抑制P65表達(dá)及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位有關(guān)。