郝建，郝華，徐芬，徐靜，張建，李里香，曾磊

(1蚌埠市第三人民醫(yī)院，安徽蚌埠233000；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

敗血癥是重癥醫(yī)學(xué)科的常見(jiàn)病癥，臨床表現(xiàn)為全身系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答，可由細(xì)菌感染或外傷引起，最常見(jiàn)的病因?yàn)楦锾m陰性菌中的脂多糖(LPS)刺激。敗血癥發(fā)生的病理生理過(guò)程中常伴有腫瘤壞死因子α(TNF-α)的大量釋放，引起細(xì)胞和組織的過(guò)度氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞和組織的廣泛損傷。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)參與炎癥的啟動(dòng)、發(fā)生發(fā)展過(guò)程及氧化應(yīng)激的調(diào)控過(guò)程[1～3]。Nrf2作為氧化還原反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，調(diào)控了抗氧化反應(yīng)元件和其下游所編碼的很多二期解毒酶和抗氧化酶，其中包括醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO-1)等。單核-巨噬細(xì)胞在敗血癥及腫瘤等諸多病理過(guò)程中扮演重要角色。LPS可誘導(dǎo)單核細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)增加。前期研究[4～6]結(jié)果表明，脂氧素及其類似物BML-111在抗炎、促進(jìn)炎癥消退方面發(fā)揮重要作用。本研究以人單核細(xì)胞株U937為研究對(duì)象，以LPS模擬炎癥模型，采用BML-111預(yù)處理U937細(xì)胞，觀察BML-111對(duì)炎癥狀態(tài)U937細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人單核細(xì)胞株U937購(gòu)于中科院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含20%胎牛血清、雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃。當(dāng)80%～90%的細(xì)胞融合時(shí)進(jìn)行傳代，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RPMI1640干粉購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司。TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR擴(kuò)增儀均購(gòu)于美國(guó)MJ Research公司。兔抗人Nrf2抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。FITC熒光二抗(山羊抗兔)購(gòu)于武漢博士德公司。BML-111購(gòu)于美國(guó)Cayman公司。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程有限公司。羥乙基哌嗪乙硫磺酸及L-谷胺酰胺、雙抗均購(gòu)于Amresco公司。PCR引物由上海賽百盛公司合成。

1.2 炎癥細(xì)胞模型制作及BML-111給藥方法 將U937細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組不加入藥物；模型組加入1 μg/L[7,8]的LPS制作炎癥模型；實(shí)驗(yàn)組先加入200 μg/L[7]的BML-111預(yù)處理30 min后再加入1 μg/L的LPS。

1.3 各組細(xì)胞中Nrf2蛋白檢測(cè) 將U937細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至30%時(shí)按“1.2”中的分組進(jìn)行給藥，作用24 h后棄上清液，部分細(xì)胞即黏附于蓋玻片上。用PBS沖洗2次，加入冰甲醇漿培養(yǎng)板放置在-20 ℃冰箱固定約10 min。用濃度為0.2%的Triton PBS洗2次，再用濃度為0.5%的Triton PBS破膜10 min，PBS沖洗5 min。采用濃度為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉約40 min。加入Nrf2一抗后放置于4 ℃冰箱孵育4 h后，PBS沖洗3次、每次5 min，用FITC標(biāo)記的熒光二抗在室溫條件下孵育約1 h，最后用Hoechest33258染料染細(xì)胞核約15 min。在熒光顯微鏡下觀察Nrf2的表達(dá)定位，拍照，采用Image J軟件對(duì)熒光圖片進(jìn)行半定量分析，以熒光強(qiáng)度表示Nrf2的表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 各組細(xì)胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA檢測(cè) 采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，其中包括12.5 μL的PCR混合液，5 mmol/L的上、下游引物各1 μL，1.5 μL的cDNA，其余用無(wú)菌水補(bǔ)足總體積?；蛞镉肞rimer5.0軟件設(shè)計(jì)，目的基因、內(nèi)參基因的引物序列和相應(yīng)的反應(yīng)條件見(jiàn)表1。將上述樣本放置在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.6%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。各目的基因的相對(duì)表達(dá)量以目的基因的拷貝數(shù)與GAPDH基因的拷貝數(shù)之比表示。

2 結(jié)果

對(duì)照組細(xì)胞中Nrf2蛋白主要定位于胞核與胞質(zhì)；模型組細(xì)胞中Nrf2蛋白主要定位于胞核，即從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至核內(nèi)；實(shí)驗(yàn)組Nrf2蛋白表達(dá)定位與對(duì)照組相近。對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.000 0±0.065 57、2.223 3±0.080 21和0.973 3±0.045 09；模型組Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模型組(P均<0.05)。模型組中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表1 目的基因、內(nèi)參基因的引物序列及PCR反應(yīng)條件

表2 各組U937細(xì)胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNFα mRNA表達(dá)比較

3 討論

單核-巨噬細(xì)胞在炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。巨噬細(xì)胞在致炎因子的作用下，發(fā)揮其氧化應(yīng)激作用，目的是消除病原體、清除腫瘤細(xì)胞，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但如果機(jī)體的炎癥反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，勢(shì)必造成細(xì)胞和組織的過(guò)度損傷，不利于組織修復(fù)。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤即是慢性炎癥經(jīng)久不愈的結(jié)果。因此，如何使炎癥可控，如何使腫瘤組織中的炎癥及時(shí)消退，成為當(dāng)前炎癥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在一些有害因子的作用下，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇(ROS)和活性氮自由基(RNS)，而機(jī)體的清除能力有限，從而導(dǎo)致氧化與抗氧化平衡被打破的病理過(guò)程。各種炎癥過(guò)程特別是敗血癥(LPS引起)的發(fā)生涉及了氧化應(yīng)激過(guò)程，其中發(fā)揮主要作用的是各種炎細(xì)胞包括單核細(xì)胞。敗血癥的促發(fā)因素有很多，主要包括細(xì)菌感染(內(nèi)毒素釋放)、缺血、缺氧等因素，其中細(xì)菌感染是最常見(jiàn)的病因。在氧化應(yīng)激過(guò)程中，Nrf2發(fā)揮著調(diào)控功能。ROS能激活轉(zhuǎn)錄因子如Nrf2、NF-κB的表達(dá)。Nrf2作為氧化還原反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，調(diào)控抗氧化反應(yīng)元件和其下游所編碼的許多二期解毒酶和抗氧化酶，其中包括NQO1、HO-1等。脂氧素類似物BML-111在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗炎和促炎癥消退功能。前期研究[9]表明，脂氧素能緩解大鼠缺血缺氧性腦損傷。在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，BML-111能減輕肝損傷和肝纖維化[4,5]。脂氧素還能調(diào)控RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞周期[6]，而且在調(diào)節(jié)細(xì)胞間的免疫反應(yīng)、抑制腫瘤等多方面發(fā)揮著重要作用[10,11]。新近研究[12]表明，脂氧素A4(LXA4)能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS的作用下，Nrf2蛋白及基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，意味著巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)增強(qiáng)。而在BML-111預(yù)處理后，U937細(xì)胞中Nrf2、NQO1、HO-1基因表達(dá)明顯減弱，以促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激，更好地發(fā)揮其氧化吞噬及抗炎功能。生理狀態(tài)下，Nrf2與Keapl結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)處于失活或抑制狀態(tài)。而在外界刺激因素作用下，細(xì)胞內(nèi)的Nrf2蛋白與Keapl蛋白發(fā)生分離，Nrf2蛋白轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，這樣Nrf2就可以與抗氧化反應(yīng)元件ARE上的相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，從而啟動(dòng)下游酶的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化功能[13～19]。NQO1是細(xì)胞內(nèi)的一種黃素酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，抑制氧化應(yīng)激。HO-1蛋白的激活可由很多因素誘導(dǎo)，如內(nèi)毒素、高熱、缺氧等，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。炎癥過(guò)程中，通常伴有促炎細(xì)胞因子的釋放，TNF-α即是炎癥過(guò)程中非常重要的促炎因子。本研究發(fā)現(xiàn)，BML-111能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)。還有研究[20，21]發(fā)現(xiàn)，Nrf2還在腫瘤發(fā)生及腫瘤耐藥方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此推測(cè)BML-111在抗腫瘤方面的作用也可能與Nrf2密切相關(guān)。

綜上所述，BML-111預(yù)處理后，炎癥狀態(tài)的U937細(xì)胞中Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位受抑制，Nrf2蛋白及其下游基因表達(dá)下調(diào)，TNF-α基因表達(dá)下調(diào)；BML-111可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2蛋白及其下游基因表達(dá)、下調(diào)TNF-α表達(dá)從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。本研究結(jié)果為BML-111用于治療敗血癥及炎癥相關(guān)性腫瘤提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而BML-111調(diào)控Nrf2的具體信號(hào)通路非常復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入研究，并需要在動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。