PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二聯(lián)亞單位疫苗的研究

劉國(guó)陽(yáng)，華 濤，喬緒穩(wěn)，唐 波，常 晨，侯繼波，李錦春，張道華

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)病和豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)病是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病。PPV是一種高度穩(wěn)定且持久感染的自主型病毒，可導(dǎo)致胚胎的死亡、吸收、木乃伊胎、死產(chǎn)、母豬分娩周期延長(zhǎng)、不育等一系列典型的繁殖障礙疾病[1-3]。PCV是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，在自然界中分布十分廣泛，包括PCV1和PCV2 2種血清型，其中PCV1無(wú)致病性，而PCV2對(duì)豬具有很強(qiáng)的感染能力，不同品種、日齡和性別的豬群均可感染[4]。PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，其主要侵害豬體的免疫系統(tǒng)，降低被感染豬的免疫力，使豬體產(chǎn)生免疫抑制[5-7]，但其單獨(dú)感染并不能引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀，只有與其他病原混合感染才會(huì)表現(xiàn)出不同的臨床癥狀。多病原混合、協(xié)同感染是目前豬群中PCV相關(guān)疾病流行的主要模式，也是此類疾病防控的主要難點(diǎn)[8-10]。臨床上PPV和PCV2的混合感染非常普遍且癥狀嚴(yán)重，兩者混合感染后PPV能明顯促進(jìn)PCV2增殖，加重PMWS的病理?yè)p傷及PCV2相關(guān)疾病的臨床癥狀，這在實(shí)驗(yàn)室及臨床上均已得到證實(shí)[11-12]。

VP2蛋白是PPV病毒衣殼蛋白的主要成分，約占衣殼蛋白的90%，有9個(gè)線性B細(xì)胞抗原表位，能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗PPV病毒的特異性中和抗體[13]，同時(shí)VP2基因也決定著PPV病毒的血凝活性，影響病毒的宿主范圍和進(jìn)化關(guān)系。PPV不同毒株之間的差異一般表現(xiàn)為VP2基因的不同，其編碼產(chǎn)物VP2蛋白對(duì)病毒感染至關(guān)重要，有研究表明，用VP2蛋白的抗體封閉PPV易感宿主，病毒將喪失對(duì)易感細(xì)胞的侵染性[14]。

PCV2 ORF2基因編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Cap，Cap蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，其N端的前41個(gè)氨基酸高度保守并富含精氨酸及堿性氨基酸，是其核定位信號(hào)區(qū)域(NLS)，這段序列誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中會(huì)大量消耗大腸桿菌中編碼精氨酸的tRNA，影響宿主菌繁殖，從而限制蛋白合成速度，甚至?xí)种频鞍踪|(zhì)的合成，導(dǎo)致蛋白合成的早期終止[15]。Liu等[16]用大腸桿菌表達(dá)PCV2 ORF2全基因，但表達(dá)量較低，甚至檢測(cè)不到Cap蛋白。Liu等[17]對(duì)PCV2結(jié)構(gòu)蛋白B表位的分析表明，該蛋白含有特異性表位抗原，具有很強(qiáng)的免疫原性，并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體。

疫苗免疫是預(yù)防PPV和PCV2相關(guān)疾病的主要手段，VP2蛋白和Cap蛋白均具有病毒的主要抗原表位，是研制病毒基因工程疫苗的重要靶標(biāo)。為了有效地預(yù)防這2種疾病，國(guó)內(nèi)外許多研究人員進(jìn)行了相關(guān)疫苗的研究，但成功上市的有關(guān)PPV和PCV2的疫苗仍全部為單苗，關(guān)于PPV和PCV2二聯(lián)疫苗的報(bào)道非常少見，大腸桿菌表達(dá)的二聯(lián)亞單位疫苗更是尚未見報(bào)道。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出可溶性的PCV2 Cap蛋白和PPV VP2蛋白，并將2種蛋白聯(lián)合乳化制備二聯(lián)亞單位疫苗，通過(guò)皮下注射途徑免疫小鼠，檢測(cè)其細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平，以期為后期PCV2和PPV二聯(lián)亞單位疫苗的研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

PCV2 NJ株和PPV NJ株均由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離鑒定和保存。PCV2利用PK-15a細(xì)胞增殖，滴度(TCID50)可達(dá)10-6.5mL-1；PPV NJ株利用ST細(xì)胞增殖，TCID50可達(dá)10-7.0mL-1。pET-32a表達(dá)載體、原核表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)及小鼠PPV和PCV2陽(yáng)性、陰性血清，均由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心動(dòng)物疫苗產(chǎn)品研究室制備保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DAN提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PCR試劑、pMD18-T載體及異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和SYBR熒光染料，均購(gòu)于TaKaRa公司；PVDF膜，購(gòu)自MILLIPORE公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購(gòu)自Axy GEN公司；豬抗PCV2多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)VMRD公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體和MTT，生興公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記葡萄球菌A蛋白和DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；免疫佐劑ISA201，法國(guó)SEPPIC公司生產(chǎn)；PCV2抗體檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)試劑。

4～5周齡ICR小鼠，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 目的基因的合成與克隆

1.2.1 目的基因的合成 獲取GenBank中的PCV2 ORF2基因和PPVVP2基因全序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，設(shè)計(jì)截去NLS信號(hào)肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和VP2蛋白氨基酸序列，按照大腸桿菌偏嗜密碼子，優(yōu)化合成對(duì)應(yīng)的基因序列，在2段基因序列兩端均分別添加BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位點(diǎn)?；蛐蛄杏赡暇┙鹚谷鹕锟萍脊竞铣珊螅寺〉絧UC57載體上。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過(guò)BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切，將基因片段Cap和VP2從pUC57上切下，克隆到表達(dá)載體pET-32a上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Cap和pET32a-VP2，并進(jìn)行BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切鑒定。

1.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)與鑒定

1.3.1 重組質(zhì)粒的表達(dá) 將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32a-Cap和pET32a-VP2分別轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于氨芐青霉素(Amp)抗性的LB平板，挑取單菌落，得到重組菌pET32a-Cap/BL21和pET32a-VP2/BL21。將空質(zhì)粒pET-32a按照相同的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，得到對(duì)照菌株pET-32a/BL21。挑取重組菌pET32a-Cap/BL21和pET32a-VP2/BL21單菌落，接種于5 mL Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后作為母液。次日，將母液按體積比1∶70轉(zhuǎn)接于氨芐抗性的新LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min振蕩培養(yǎng)1.5～2 h， 使菌液在600 nm處的吸光值(D600 nm)達(dá)0.8～1.0。向pET32a-Cap/BL21菌液加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)36 h；向pET32a-VP2/BL21菌液加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)24 h。收獲2種菌液，備用。

1.3.2 重組蛋白的可溶性分析 取10 mL上述誘導(dǎo)的菌液，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集菌體，用10 mL PBS緩沖液(pH 7.2)重懸，于冰水浴中超聲波破碎細(xì)菌，取樣(全菌對(duì)照)，然后4 ℃下12 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀用10 mL PBS緩沖液重懸。取全菌、BL21空菌、上清液和沉淀,加入5×Loading buffer，100 ℃煮沸制備蛋白電泳樣品，采用SDS-PAGE方法檢測(cè)重組蛋白的可溶性。

1.3.3 重組蛋白的Western-blotting鑒定 將SDS-PAGE蛋白電泳分離的蛋白條帶電轉(zhuǎn)到PVDF轉(zhuǎn)移膜上，用50 g/L的脫脂奶粉于37 ℃封閉孵育1 h，PBST洗滌3次，加3 000倍稀釋的小鼠陽(yáng)性血清，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST緩沖液充分洗滌5次(5 min/次)，加5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBST緩沖液充分洗滌5次(5 min/次)；按照DAB顯色試劑盒說(shuō)明書顯色。

1.4 目的蛋白的純化與定量

大量表達(dá)Cap和VP2蛋白，超聲波破碎(400 W，工作5 s，間隔5 s，重復(fù)25次至菌體溶液變清澈)后，利用GEM顆粒純化法[18]純化Cap蛋白，采用飽和硫酸銨沉淀法[19]純化VP2蛋白。取純化后的樣品，與1.3.2節(jié)樣品一起進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting分析。利用商品化BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.5 疫苗的制備

取純化的Cap和VP2蛋白適當(dāng)稀釋，按照一定的體積比配制不同的疫苗：(1) Cap和VP2蛋白單苗：V(ISA201佐劑)∶V(抗原蛋白)=1∶1，Cap和VP2抗原蛋白最終的質(zhì)量濃度均為250 μg/mL；(2)Cap和VP2蛋白二聯(lián)亞單位疫苗：V(ISA201佐劑)∶V(Cap蛋白)∶V(VP2蛋白)=2∶1∶1，Cap和VP2抗原蛋白終質(zhì)量濃度均為250 μg/mL；(3)大腸桿菌BL21對(duì)照：V(ISA201佐劑)∶V(大腸桿菌BL21空菌)=1∶1；(4)PBS空白對(duì)照：V(ISA201佐劑)∶V(PBS)=1∶1。

1.6 重組蛋白的免疫特性研究

取50只6～8周齡雌性清潔級(jí)ICR小鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只。對(duì)小鼠進(jìn)行首次免疫，其中第1～3組分別為Cap蛋白單苗組、VP2蛋白單苗組、Cap和VP2蛋白二聯(lián)亞單位疫苗組，小鼠頸、背部皮下多點(diǎn)注射相應(yīng)的疫苗0.2 mL/只；第4組和第5組分別為大腸桿菌BL21對(duì)照組和PBS空白對(duì)照組，小鼠分別注射相應(yīng)的液體，注射途徑、劑量同上。首次免疫后21 d采用眼眶采血法采集小鼠血液，分離血清，同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行二次免疫(免疫方法和劑量同首次免疫)，42 d采集血清(方法同前)，2次所獲血清用于PCV2 ELISA 抗體、PPV HI抗體和中和抗體水平檢測(cè)。同時(shí)，42 d時(shí)每組剖殺一半小鼠，無(wú)菌取脾臟，用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞因子檢測(cè)。56 d時(shí)采集小鼠血清(方法同前)用于PCV2 ELISA 抗體、PPV HI抗體和中和抗體水平檢測(cè)，并取PCV2 NJ株和PPV NJ株病毒液作適當(dāng)稀釋得混合病毒液(病毒含量均為106mL-1)，腹腔接種各組剩余的5只小鼠，接種體積為0.5 mL/只，攻毒后21 d剖殺小鼠，無(wú)菌摘取脾臟，用于PCV2和PPV病毒含量測(cè)定。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行。

1.6.1 PCV2 ELISA抗體和PPV HI抗體效價(jià)的檢測(cè) PCV2 ELISA抗體檢測(cè)：使用上海酶聯(lián)生物科技有限公司PCV2間接ELISA試劑盒檢測(cè)血清抗體，2倍倍比稀釋小鼠血清，以檢測(cè)孔呈陰性時(shí)的血清最低稀釋度的倒數(shù)作為血清的抗體效價(jià)。PPV HI抗體檢測(cè)：參照“豬細(xì)小病毒病滅活疫苗(NJ株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”中的血清HI抗體檢測(cè)方法，以能夠抑制50%豚鼠紅細(xì)胞凝集的血清最高稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)(以2為底)為小鼠血清PPV HI抗體效價(jià)。

1.6.2 免疫血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定 采用固定病毒稀釋血清的方法對(duì)免疫小鼠血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，以能夠減少50%特異性熒光灶的血清最低稀釋倍數(shù)作為待檢血清的中和抗體滴度。將待檢小鼠血清置于56 ℃滅活30 min，用含體積分?jǐn)?shù)2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基2倍倍比稀釋已滅活血清，取不同稀釋度的血清與病毒含量為103mL-1的病毒液等體積混合，37 ℃下中和感作2 h，接種已鋪滿單層細(xì)胞(PPV病毒采用ST細(xì)胞，PCV2病毒采用PK-15a細(xì)胞)的96孔板中(接種量200 μL/孔)，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照、病毒對(duì)照(PPV或PCV2)和健康細(xì)胞(ST細(xì)胞或PK-15a細(xì)胞)對(duì)照。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,采用間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測(cè)各孔的感染情況，根據(jù)Reed-Muench法[20]計(jì)算血清中和抗體效價(jià)。

1.6.3 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 取上述無(wú)菌采集的小鼠脾臟，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾臟淋巴細(xì)胞，以含體積分?jǐn)?shù)10% 新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度約為5×106mL-1，鋪96孔板(100 μL/孔)，每只小鼠樣品鋪12個(gè)孔，用PPV和PCV2預(yù)混病毒液(病毒最終含量均為5×106mL-1)作為試驗(yàn)組，以刀豆蛋白ConA(終質(zhì)量濃度5 μg/mL)作為刺激抗原的陽(yáng)性對(duì)照組(判斷實(shí)驗(yàn)是否成立)，以及營(yíng)養(yǎng)液處理的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)。各組細(xì)胞置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h，每孔加入25 μL MTT(終質(zhì)量濃度5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，3 500 r/min離心5 min，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩溶解紫色結(jié)晶，570 nm處測(cè)定吸光值(D570 nm)，取4個(gè)重復(fù)孔的平均D570 nm值計(jì)算刺激指數(shù)(SI)：SI=試驗(yàn)組D570 nm/營(yíng)養(yǎng)液對(duì)照組D570 nm。以SI作為判斷淋巴細(xì)胞增殖程度的參數(shù)。

1.6.4 細(xì)胞因子mRNA水平的檢測(cè) 無(wú)菌分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(方法同1.6.3節(jié))，鋪24孔板，按感染復(fù)數(shù)為1∶1加入淋巴細(xì)胞和PPV、PCV2預(yù)混病毒液，1 mL/孔，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，3 500 r/min離心5 min，棄上清，每孔加入500 μL Trizol振蕩裂解細(xì)胞，提取RNA，采用一步反轉(zhuǎn)試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。

根據(jù)Genbank中的白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)基因相關(guān)序列(Genbank登錄號(hào)分別為：M29854、L20001、X53085和X54859)設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。參照王永帥等[21]的研究，以β-actin為內(nèi)參基因(引物見表1)，利用熒光定量PCR法檢IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平。

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列Table 1 Primer sequences for PCR in this experiment

1.6.5 Real-time PCR定量檢測(cè)PPV和PCV2 稱取相同質(zhì)量的小鼠脾臟，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書分別提取PPV和PCV2病毒DNA，采用Real-time PCR法檢測(cè)脾臟中2種病毒的含量。試驗(yàn)在羅氏熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)設(shè)ddH2O為陰性對(duì)照，得到對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[21]計(jì)算0.1 g樣品中的PCV2和PPV核酸拷貝數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用GraphPad PRISM軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET32a-Cap和pET32a-VP2的鑒定

構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Cap和pET32a-VP2經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后分別獲得了687和1 740 bp的目的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒pET32a-Cap和pET32a-VP2構(gòu)建成功。

M1.DL2000 DNA Marker；1.pET32a-Cap的BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果；M2.DL10000 DNA Marker；2.pET32a-VP2的BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果M1.DL2000 DNA Marker;1.Digestion product by BamHⅠ and Hind Ⅲ from pET32a-Cap;M2.DL10000 DNA Marker;2.Digestion product by BamHⅠ and Hind Ⅲ from pET32a-VP2圖1 pET32a-Cap和pET32a-VP2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Double-enzyme digestion products of recombinant plasmids pET32a-Cap and pET32a-VP2

2.2 Cap和VP2蛋白的表達(dá)及純化

SDS-PAGE分析結(jié)果表明，PCV2 Cap重組蛋白主要存在于菌體裂解的上清液中，沉淀中蛋白含量極低(圖2-A)；PPV VP2重組蛋白以包涵體和上清液2種形式存在，但以上清液中含量較高(圖3-A)。Western-blotting結(jié)果顯示，Cap和VP2重組蛋白均可以與相應(yīng)陽(yáng)性血清反應(yīng)，分別在27 ku(圖2-B)和67 ku(圖3-B)處有清晰的特異性條帶出現(xiàn)，表明重組蛋白可被特異性的抗體所識(shí)別，具有較好的免疫原性。2種重組蛋白純化后，PCV2 Cap蛋白獲得較為單一的條帶，PPV VP2蛋白純度也顯著提高，表明2種蛋白的純化效果良好(圖2，3)，純化后，PCV2 Cap蛋白質(zhì)量濃度為1 213 μg/mL，PPV VP2蛋白質(zhì)量濃度為1 025 μg/mL。

2.3 PCV2 ELISA抗體和PPV HI抗體效價(jià)的檢測(cè)

由圖4-A可知，首免后21 d，Cap單苗和Cap/VP2二聯(lián)苗免疫組小鼠血清的PCV2 ELISA抗體效價(jià)高于400；免疫后42～56 d，小鼠血清PCV2 ELISA抗體明顯上升，42 d時(shí)達(dá)到800以上，56 d時(shí)均超過(guò)3 200，二聯(lián)亞單位疫苗組與Cap蛋白單苗組間無(wú)明顯差異。大腸桿菌BL21對(duì)照組、PBS空白對(duì)照組及VP2單苗免疫組PCV2 ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性。

由圖4-B可知，首次免疫后21 d，各免疫組PPV HI抗體效價(jià)≤5，低于疫苗合格標(biāo)準(zhǔn)(HI抗體效價(jià)≥6)；免疫后42 d，Cap/VP2二聯(lián)苗免疫組和VP2蛋白單苗免疫組抗體水平上升，HI抗體效價(jià)均大于6，達(dá)到PPV疫苗合格標(biāo)準(zhǔn)，且二聯(lián)苗與單苗差異不明顯；免疫后56 d，HI抗體效價(jià)仍保持較高水平(HI抗體效價(jià)>6)。大腸桿菌BL21對(duì)照組、PBS空白對(duì)照組及Cap蛋白單苗組PPV HI抗體檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。

M1.CLEARLY蛋白質(zhì)Marker；1.Cap重組菌裂解沉淀；2.Cap重組蛋白上清液純化樣品；3.Cap重組菌裂解上清液；4.Cap重組菌全菌對(duì)照；5.BL21空菌對(duì)照；M2.PageRuler蛋白質(zhì)MarkerM1.CLEARLY protein Marker;1.Sediment for recombinant plasmid pET32a-Cap transformed BL21 after supersonic;2.Supernatant for pET32a-Cap;3.Supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pET32a-Cap transformed BL21;4.Whole bacterium of BL21 transformed with pET32a-Cap;5.Blank control of BL21 transformed with plasmid;M2.PageRuler protein Marker圖2 PCV2 Cap重組蛋白的SDS-PAGE (A)及Western blotting (B)分析Fig.2 Analyses of PCV2 Cap recombinant protein by SDS-PAGE(A) and Western blotting(B)

M1.CLEARLY蛋白質(zhì)Marker；1.VP2重組菌裂解沉淀；2.VP2重組蛋白上清液純化樣品；3.VP2重組菌裂解上清液；4.VP2重組菌全菌對(duì)照；5.BL21空菌對(duì)照；M2.PageRuler蛋白質(zhì)MarkerM1.CLEARLY protein Marker;1.Sediment for recombinant plasmid pET32a-VP2 transformed BL21 after supersonic;2.Supernatant for pET32a-VP2;3.Supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pET32a-VP2 transformed BL21;4.Whole bacterium of BL21 transformed with pET32a-VP2;5.Blank control of BL21 transformed with plasmid;M2.PageRuler protein Marker圖3 PPV VP2重組蛋白的SDS-PAGE (A)及Western blotting (B)分析Fig.3 Analyses of PPV VP2 recombinant protein by SDS-PAGE(A) and Western blotting(B)

圖4 免疫后小鼠血清PCV2 ELISA抗體效價(jià)(A)和PPV HI抗體效價(jià)(B)Fig.4 PCV2 ELISA antibody titers (A) and PPV HI antibody titers (B) in vaccinated mice serum

2.4 PCV2和PPV病毒中和效價(jià)的檢測(cè)

由圖5-A可知，與大腸桿菌BL21對(duì)照組、PBS空白對(duì)照組及VP2單苗組相比，Cap/VP2二聯(lián)苗免疫組與Cap單苗組小鼠在免疫后21 d可產(chǎn)生中和抗體，效價(jià)最高可達(dá)16，且組間差異不明顯；在免疫后42 d，血清中和效價(jià)均在32～38，組間無(wú)明顯差異；在免疫后56 d，血清中和效價(jià)仍保持在34～38，與免疫后42 d結(jié)果相比無(wú)明顯變化，且Cap/VP2二聯(lián)苗組與Cap單苗組無(wú)明顯差異。大腸桿菌BL21對(duì)照組、PBS空白對(duì)照組及VP2蛋白單苗免疫組PCV2中和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

由圖5-B可知，Cap/VP2二聯(lián)苗免疫組與VP2蛋白單苗組小鼠在免疫后21 d可檢測(cè)到PPV病毒的血清中和抗體；在免疫后42 d血清中和抗體效價(jià)較高，均在300～350，組間差異不明顯；在免疫后56 d，血清中和抗體無(wú)明顯上升，與免疫后42 d相當(dāng)。大腸桿菌BL21對(duì)照組、PBS空白對(duì)照組及Cap蛋白單苗免疫組PPV中和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

圖5 免疫后小鼠血清PCV2(A)和PPV(B)中和抗體效價(jià)Fig.5 Anti-PCV2 (A)and anti-PPV (B) neutralization antibody titers in vaccinated mice serum

2.5 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

由圖6可知，與大腸桿菌BL21對(duì)照組、PBS空白對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)顯著升高，其中Cap/VP2二聯(lián)亞單位疫苗免疫組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)高于2.0，顯著高于Cap和VP2蛋白單苗免疫組(P<0.05)，2個(gè)單苗組之間脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.6 小鼠細(xì)胞因子mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果

由圖7可知，利用PPV和PCV2病毒作為刺激原，3個(gè)免疫組小鼠IFN-γ和IL-4的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于大腸桿菌BL21對(duì)照組、PBS空白對(duì)照組(P<0.05)；各試驗(yàn)組小鼠IL-10和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.7 小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

由圖8可知，3個(gè)免疫組小鼠脾臟中的PPV和PCV2含量均顯著低于大腸桿菌BL21對(duì)照組和PBS空白對(duì)照組;3個(gè)免疫組間及2個(gè)對(duì)照組間PPV和PCV2含量差異不顯著。Cap/VP2二聯(lián)亞單位疫苗免疫組小鼠脾臟PCV2含量顯著低于單苗免疫組；VP2蛋白單苗免疫組PCV2含量高于Cap蛋白免疫組，但差異不顯著。

不同免疫組相比，圖柱中標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下圖同Different lowercase letters indicate significant difference among immune groups at P<0.05 level.The same below圖6 免疫后42 d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)Fig.6 Lymphocyte proliferative response in mice 42 d after vaccination

圖7 免疫后42 d小鼠相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的檢測(cè)Fig.7 Detection of mRNA level of cytokine in mice 42 d after vaccination

圖8 免疫攻毒試驗(yàn)小鼠0.1 g脾臟樣品中PPV和PCV2含量Fig.8 Virus titers in 0.1 g mice spleen after challenge test

3 討 論

PMWS是由PCV2病毒引起的一種消耗性疾病，自1991年加拿大首次報(bào)道后，該病相繼在世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[22-23]。Allan等[22]研究證實(shí)，PPV可增強(qiáng)PCV2對(duì)機(jī)體的侵染能力，加重PMWS的臨床癥狀，臨床調(diào)查結(jié)果表明，大約15%患有PMWS的仔豬為PPV和PCV2混合感染，這給PMWS的防治工作帶來(lái)了巨大困難。目前，PMWS的防治措施是疫苗免疫，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都在積極開展相關(guān)疫苗研究，市場(chǎng)上以單苗為主，仍未見PPV和PCV2二聯(lián)疫苗銷售，相關(guān)研究報(bào)道也較為少見。國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上現(xiàn)有的PCV2疫苗主要包括全病毒滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗、DNA核酸疫苗和嵌合疫苗等[24-26]，PPV疫苗也多為單苗。比較所有相關(guān)疫苗的制備工藝和免疫效果，全病毒疫苗存在一定的安全性問題，DNA核酸疫苗和嵌合疫苗生產(chǎn)成本太高，且生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的基因工程疫苗具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，表達(dá)周期較短，生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，所以很多學(xué)者和公司都希望利用此技術(shù)來(lái)生產(chǎn)PPV和PCV2疫苗。Zhou等[27]報(bào)道，PCV2 Cap蛋白N末端富含大量堿性氨基酸和大腸桿菌稀有密碼子，在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中占用大量tRNA，影響大腸桿菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。PPVVP2基因N末端也含有較多的大腸桿菌稀有密碼子，部分稀有密碼子還是連續(xù)的，這給VP2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)帶來(lái)了極大的不便[28]。

針對(duì)上述問題，結(jié)合前期研究結(jié)果，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)截短Cap蛋白N末端的NLS信號(hào)肽，以克服由于堿性氨基酸存在而導(dǎo)致的蛋白表達(dá)效率低的問題。并根據(jù)大腸桿菌的偏嗜密碼子設(shè)計(jì)ORF2基因和VP2基因，優(yōu)化Cap蛋白和VP2蛋白表達(dá)條件，獲得了2種溶解性良好的重組蛋白，并通過(guò)GEM純化技術(shù)和硫酸銨沉淀技術(shù)使蛋白純度大大提高，經(jīng)Western-blotting鑒定，重組蛋白可被特異性的抗體識(shí)別，具有良好的免疫原性。大量表達(dá)Cap蛋白和VP2蛋白制備相應(yīng)的亞單位單苗和二聯(lián)疫苗，免疫ICR小鼠，血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果表明，重組蛋白免疫小鼠后能夠誘發(fā)良好的體液免疫應(yīng)答，二聯(lián)亞單位疫苗免疫小鼠后抗體水平與單苗相當(dāng)，且在機(jī)體內(nèi)無(wú)相互免疫抑制作用。淋巴細(xì)胞增殖和相關(guān)細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果表明，重組蛋白免疫小鼠后能夠有效刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，并且可提高IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)T細(xì)胞分化，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。對(duì)免疫小鼠進(jìn)行PPV和PCV2混合攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明本研究制備的亞單位疫苗可為小鼠提供有效的保護(hù)。

4 結(jié) 論

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功獲得了溶解性良好的Cap蛋白和VP2蛋白，乳化制苗免疫小鼠后均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的體液免疫應(yīng)答和特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且能夠?yàn)闄C(jī)體提供較好的保護(hù)。