間充質(zhì)干細(xì)胞干性維持及多向分化相關(guān)LncRNA的研究進(jìn)展

羅金蓮，余澤波，王 靜，李 青，闕文君，胡 雪，詹廷西

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科， 重慶 400016)

干細(xì)胞(stem cells)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。自我更新是指干細(xì)胞分裂產(chǎn)生至少1個(gè)具有干細(xì)胞特性子細(xì)胞的過程。分化潛能是指未分化的干細(xì)胞在一定條件下可分化為各種類型的細(xì)胞。自我更新能維持干細(xì)胞具有多分化的潛能。對(duì)于組織特異性干細(xì)胞而言，自我更新是維持其終生具有分化潛能的基礎(chǔ)[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，同時(shí)也存在于其他組織中，如脂肪組織和臍帶等。MSCs增殖與分化的平衡決定其最終歸宿：平衡狀態(tài)下，MSCs發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪或其他類型的細(xì)胞；失衡狀態(tài)下，則可能發(fā)生骨肉瘤等骨病變。因此，明確MSCs增殖與分化的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于骨肉瘤治療和骨組織工程發(fā)展等都具有重要意義。

近年來，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)對(duì)MSCs干性維持及多向分化的調(diào)節(jié)作用受到越來越多的關(guān)注。LncRNA是一類長(zhǎng)度大于 200個(gè)核苷酸的非編碼 RNA，曾被認(rèn)為是無作用的轉(zhuǎn)錄“噪聲”。然而，隨著生物信息學(xué)和測(cè)序技術(shù)進(jìn)步，越來越多的證據(jù)表明，LncRNA可能在許多生理病理過程中起著重要的調(diào)控作用，如干性維持和細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、基因組印記、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、腫瘤增殖遷移等。本研究通過分析國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就LncRNA在MSCs干性維持、多向分化及成瘤中的功能及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 LncRNA與MSCs干性維持的關(guān)系

MSCs的干性維持包括兩個(gè)方面：自我增殖能力和分化全能性或多能性，即在合適條件下，MSCs能一直傳代下去，而且分化全能性保持不變。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)：LncRNA是MSCs轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，對(duì)維持MSCs多向分化潛能起著關(guān)鍵作用。Sheik 等通過對(duì)小鼠ESCs全基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，尋找與ESCs干性維持相關(guān)的LncRNA。他們發(fā)現(xiàn)LncRNA AK028326是Oct4的直接靶標(biāo)，在調(diào)節(jié)反饋環(huán)中共激活Oct4。LncRNA AK141205是Nanog的直接靶標(biāo)，可抑制Nanog活性。通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了這些LncRNA不僅是由mESC人轉(zhuǎn)錄因子控制，而且LncRNA本身就可以調(diào)控mESC發(fā)育狀態(tài)[1]。Wang等[2]報(bào)道：linc-RoR在人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)的分化過程中表達(dá)急劇下降，linc-RoR可能作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA (ceRNA)調(diào)控Oct4、 Sox2和 Nanog的表達(dá)。Kretz等[3]的研究表明：LncRNA DANCR (anti-differentiation ncRNA， DANCR) 在細(xì)胞分化過程中表達(dá)急劇下降。Zhu等[4]的研究表明：DANCR可通過與 enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) 相互作用，抑制Runx2表達(dá)，從而使細(xì)胞停留在未分化狀態(tài)。Jia等[5]則發(fā)現(xiàn)：下調(diào)DANCR可能通過經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)牙周膜MSCs的增殖和成骨分化。這些研究均提示DANCR在維持細(xì)胞干性方面起著重要作用，并且表明多種LncRNA在細(xì)胞干性維持方面起著重要的調(diào)控作用。

2 LncRNA 與MSCs分化的關(guān)系

2.1 與MSCs成骨分化相關(guān)的LncRNA

骨形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，同一祖細(xì)胞在眾多因素的作用下分化成為不同類型的骨組織。目前對(duì)成骨過程中LncRNA發(fā)揮的作用所知甚少，一些研究者對(duì)其進(jìn)行了積極的探索。

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2) 蛋白在成骨細(xì)胞的分化和骨形成方面起重要的作用。Zhu和Jia[4]的研究表明：DANCR可通過與EZH2 相互作用，抑制Runx2表達(dá)，從而阻礙成骨分化；下調(diào)DANCR則可促進(jìn)MSCs的增殖和成骨分化[5]。

LncRNA H19和胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)是連鎖交互印跡的基因,二者對(duì)細(xì)胞的增殖發(fā)揮重要的調(diào)控作用。IGF2和H19的印跡控制區(qū)由差異甲基化區(qū)(differentially methylated regions，DMR)、印跡控制區(qū)(imprinting control region，ICR)和增強(qiáng)子共同調(diào)節(jié)[6-7]。最近已證實(shí)，H19基因外顯子還編碼一個(gè)微小RNA(microRNA,miRNA)分子 miR-675[8]，而H19編碼的miR-675可通過TGFβ/Smad/HDAC通路促進(jìn)了成骨分化[9]。另一方面，有研究表明：H19可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)活化Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)成骨分化[10]。筆者所在課題組前期的研究成果也表明：H19是BMP9信號(hào)通路重要的調(diào)控因素，H19可以通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路相關(guān)的miRNAs而影響成骨分化[11]。let7 miR家族已被證明是骨形成的正向調(diào)節(jié)因子， H19可以作為let-7的分子海綿調(diào)節(jié)let7的表達(dá)，使let-7的靶基因HGMA2和Dicer在蛋白水平表達(dá)上調(diào)。

Berdal等確定了一種與Msx1基因相對(duì)應(yīng)的LncRNA Msx1-as。Msx1基因在牙齒和顱面發(fā)育中具有重要作用。Msx1-as可以負(fù)性調(diào)控Msx1基因的轉(zhuǎn)錄水平，降低Msx1蛋白水平。此外，Msx1-as還可調(diào)控Msx1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，抵消Msx1對(duì)Dlx5的抑制[12-13]。

Babajko等[14]發(fā)現(xiàn)：lncRNA-LALR1通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，加速了小鼠肝細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。激活的β-catenin可抑制HOTAIR的表達(dá)[15]。Carrion等[16]發(fā)現(xiàn):敲除人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中的HOTAIR可增加成骨相關(guān)基因如堿性磷酸酶(ALPL)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2) 的表達(dá)。HOTAIR還可通過調(diào)節(jié)miR-17-5p和它的靶基因SMAD7，在調(diào)節(jié)成骨分化和增殖中扮演重要角色[17]。

Xu等[18]研究了LncRNA (hypoxia-inducible factor 1α-anti-sense 1，HIF1α-AS1)在BMSCs成骨分化中的重要作用。通過TGF-β抑制SIRT1的表達(dá)，可上調(diào)HIF1α-AS1，促進(jìn)BMSCs成骨分化。炎癥微環(huán)境能減弱BMSCs成骨分化的能力。Cui等[19]發(fā)現(xiàn)：沉默LncRNA NONHSAT009968可改善葡萄球菌A蛋白抑制的成骨分化。Li等[20]以成骨生長(zhǎng)肽刺激鼠MSCs，證明LncRNA AK141205通過對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)H4組蛋白的乙?；瘉泶龠M(jìn)CXCL13表達(dá)，從而促進(jìn)MSCs成骨分化。

表1為與MSCs成骨分化相關(guān)的LncRNA。

表1 與MSCs成骨分化相關(guān)的LncRNA

2.2 與MSCs成脂分化相關(guān)的LncRNA

PPARγ是脂肪生成的重要調(diào)控因子。Xu等[21]發(fā)現(xiàn)：在脂肪生成過程中，類固醇受體RNA激活物(steroid receptor RNA activator,SRA)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA形式(LncRNA SRA) 通過與PPARγ共激活PPARγ依賴的受體基因表達(dá)，對(duì)前脂肪細(xì)胞的分化發(fā)揮重要作用。Sun等[22]比較分析了原代棕色和白色脂肪細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞和培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了175種在脂肪生成過程中受到調(diào)控的LncRNA。這些LncRNA多數(shù)通過調(diào)節(jié)脂肪生成的重要調(diào)控因子如PPARγ、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α (CEBPα)等來影響脂肪細(xì)胞的分化。通過RNAi功能缺失(loss-of-function)實(shí)驗(yàn),確認(rèn)了其中10種 LncRNA與脂肪細(xì)胞的分化高度相關(guān)，并將其命名為lnc-RAP-1～lnc-RAP-10，其中l(wèi)nc-RAP-1 通過與異構(gòu)核核糖核酸蛋白U (hnRNPU)相互作用調(diào)節(jié)脂肪生成。近期研究發(fā)現(xiàn):Blnc1 (brown fat LncRNA 1)通過生成Blnc1/hnRNPU/EBF2核糖核酸蛋白復(fù)合物來促進(jìn)褐色和米黃色脂肪細(xì)胞的分化，增強(qiáng)UCP1等產(chǎn)熱基因的表達(dá)。此外，Blnc1本身也受EBF2調(diào)控[23-24]。Wei 等[25]的研究表明:PU.1 AS LncRNA可通過與PU.1 mRNA形成順義-反義復(fù)合物來促進(jìn)脂肪生成。上述研究結(jié)果表明:LncRNA對(duì)祖細(xì)胞的分化和脂肪生成起著重要調(diào)控作用。

表2為與MSCs成脂分化相關(guān)的LncRNA。

表2 與MSCs成脂分化相關(guān)的LncRNA

3 LncRNA與骨肉瘤的關(guān)系

骨肉瘤是一種間質(zhì)來源的腫瘤。目前認(rèn)為骨肉瘤是一種干細(xì)胞分化受阻的疾病。在干細(xì)胞分化的過程中，骨肉瘤細(xì)胞分化阻滯階段越早，腫瘤惡性程度就越高，增殖就越快，也更容易轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明：LncRNA與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。一些LncRNA 如H91、HOTAIR、TUG1、DANCR、BCAR4、FGFR3-AS1、HOTTIP、HULC、MALAT-1、UCA1等在骨肉瘤中上調(diào)，被認(rèn)為是癌基因; TUSC7和MEG3 則在骨肉瘤中下調(diào)，被認(rèn)為是抑癌基因。此外,LINC00161、HOTTIP、ODRUL的表達(dá)與骨肉瘤耐藥相關(guān)。這些 LncRNA 調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥的機(jī)制包括ceRNA、 Wnt/β-catenin pathway等[26]。

LncRNA H19不但在成骨分化中起著重要調(diào)控作用，也與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Ulaner等[27]的研究發(fā)現(xiàn)：H19和IGF2印記丟失經(jīng)常出現(xiàn)在腫瘤中。印記丟失與H19上游CTCF結(jié)合位點(diǎn)的差異甲基化有關(guān)。IGF2印記表達(dá)可引起CTCF結(jié)合位點(diǎn)去甲基化，導(dǎo)致H19印記丟失[28]，促進(jìn)骨肉瘤形成。敲除H19的小鼠出現(xiàn)過度生長(zhǎng)的表型，可能也與H19對(duì)IGF2表達(dá)的調(diào)控有關(guān)[29]。由此可見,H19可作為抑癌因子。但是，H19也可能促進(jìn)骨肉瘤形成。Li 等[30]的研究發(fā)現(xiàn)：H19可作為 ceRNA，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-200s來促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移。Chan等[31]在成熟的成骨細(xì)胞中研究了Hedgehog信號(hào)在骨肉瘤發(fā)展中的作用。結(jié)果表明：Hedgehog信號(hào)異?？梢餣ap1和 H19過表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤形成。He等[32]的研究表明：腫瘤抑制因子miR-141過表達(dá)可抑制成骨細(xì)胞增殖，在骨肉瘤中miR-141則通過下調(diào)H19或miR-675誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此可見，H19在骨肉瘤的不同時(shí)期發(fā)揮著不同的作用，可以作為抑癌因子，也可能促進(jìn)骨肉瘤形成。

Jiang等的研究表明：LncRNA DANCR對(duì)骨肉瘤有促瘤作用，過表達(dá)的DANCR在體外可增加骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)可促進(jìn)異種移植瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。pull-down分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明：DANCR可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-33a-5p，上調(diào)酪氨酸激酶受體AXL的表達(dá)。此外，DANCR可增強(qiáng)AXL-Akt通路下游的蛋白質(zhì)表達(dá)。DANCR在骨肉瘤組織中表達(dá)顯著增加，且與腫瘤大小和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是骨肉瘤不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[33]。Min等[34]敲除DANCR后，U2OS細(xì)胞增殖速率顯著減慢，且細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，同時(shí)p21表達(dá)水平上調(diào)而CDK2表達(dá)水平下調(diào)，證明DANCR可能是一種致癌基因，它促進(jìn)了骨肉瘤的增殖。

LncRNA TUG1也是一個(gè)在骨肉瘤中高表達(dá)的LncRNA。Zhang等[35]證明了敲除TUG1表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其他研究則進(jìn)一步證明：TUG1作為miR-335-5p[36]、miR-153[37]及miR-9-5p[38]的ceRNA提高了骨肉瘤細(xì)胞遷移能力和侵襲性。

LncRNA HOTAIR 在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)[39]。Li等[40]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： HOTAIR 通過 HOTAIR-miR126-DNMT1-CDKN2A軸來調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的活力和凋亡。 具體來說，HOTAIR通過抑制miR-126的表達(dá)來激活DNMT1。此外，HOTAIR通過DNA超甲基化失活CDKN2A啟動(dòng)子，從而抑制CDKN2A的表達(dá)。由此可見：HOTAIR 是一種致癌基因，能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡[41]。

LncRNA tumor suppressor candidate 7 (TUSC7，又名LOC285194) 在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)時(shí)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[42]。敲除成骨細(xì)胞中的TUSC7表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。 TUSC7是一種由p53控制的腫瘤抑制因子，通過抑制mir-211而抑制細(xì)胞增殖[43]。而miR-211是一種內(nèi)源性的Runx2 抑制劑，可抑制MSCs 成骨分化，促進(jìn)MSCs向脂肪細(xì)胞分化[44]。

與骨肉瘤相關(guān)的LncRNA見表3。

表3 與骨肉瘤相關(guān)的LncRNA

4 結(jié)束語

本文綜述了LncRNA在MSCs細(xì)胞干性維持及成骨、成脂分化過程中的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制以及對(duì)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程的影響。目前，LncRNA的研究還處于起步階段，關(guān)于LncRNA參與MSCs細(xì)胞多向分化調(diào)控的研究還比較少，其機(jī)制也尚未闡明。但是從有限的報(bào)道中可以看出：LncRNA在MCSs增殖與分化平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了非常重要的作用，不但在MCSs干性維持和多向分化方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而且與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。以DACER為例，DANCR可使MCSs細(xì)胞停留在未分化狀態(tài)，當(dāng)其下調(diào)時(shí)可促進(jìn)MSCs成骨分化，在骨肉瘤組織中DANCR表達(dá)顯著增加，且過表達(dá)的DANCR在體外可增加骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這也從另一個(gè)角度證明增殖與分化的平衡可使MSCs發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪或其他類型的細(xì)胞，當(dāng)這一平衡被打破時(shí)，則可能產(chǎn)生骨肉瘤等疾病。

LncRNA 在腫瘤診斷、臨床分期和預(yù)后判斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，也可能作為潛在的治療靶點(diǎn)為新靶向藥物開發(fā)提供依據(jù)。進(jìn)一步明確LncRNA 調(diào)控MSCs增殖與分化的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于骨組織工程發(fā)展具有重要意義，也可為腫瘤治療提供新的突破口。