吳春燕，張金寶，劉海艷，李文財，馮 巖，王 莉，任建軍，張玉彥*

(1.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，銀川 750011；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100；3. 寧夏智弘生物科技有限公司，銀川 750021)

維生素ADE注射液是以維生素A、維生素D和維生素E為主藥，輔以其他溶劑，制備成的營養(yǎng)補(bǔ)充類物質(zhì)，用于預(yù)防和治療動物維生素A、維生素D和維生素E缺乏癥[1-3]，該制劑正在申報5.1類新獸藥。目前，測定脂溶性維生素A、維生素D3和維生素E的方法主要包含分光光度法和HPLC法[4-5]，其中分光光度法是通過測定吸收度而確定樣品含量，因樣品中的輔料會對吸收度造成干擾而影響含量檢測，須經(jīng)過皂化和提取等預(yù)處理過程后進(jìn)行檢測；HPLC法具有靈敏度高、操作簡單和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，但是樣品同樣須經(jīng)過繁瑣的預(yù)處理過程后，方能進(jìn)行含量檢測。根據(jù)維生素A、維生素D3和維生素E均溶于乙醇的物理特性，結(jié)合相似相溶原理，采用無水乙醇直接提取的方法，并建立了以甲醇為流動相A、乙腈-乙醇-水(60∶25∶5)為流動相B的反相HPLC法，能有效分離維生素A、維生素D3和維生素E，來滿足實(shí)際生產(chǎn)過程中對檢驗(yàn)時間及結(jié)果的需求。結(jié)果表明該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于成品及中間體的檢測。

1 材 料

1.1 儀器 上海梅特勒托利多儀器有限公司AB265-S電子天平；日本島津LC-2010C高效液相色譜儀。

1.2 試藥與試劑 維生素A棕櫚酸酯對照品，購自德國J&K Scientific Ltd，批號為LJ10P49，含量1790,000 U/g；維生素D3對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號為100061-201208，含量99.8%；維生素E對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號為100062-201110，含量97.7%；維生素ADE注射液，寧夏智弘生物科技有限公司生產(chǎn)，批號為20121001，規(guī)格 10 mL：維生素A 1,000,000 U+維生素D3 100,000 U+維生素E 3,000 U；所有試劑均為色譜級。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇為流動相A，乙腈-乙醇-水(60：25：5)為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為265 nm；流速為1.5 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20 μL。

表1 梯度洗脫

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取維生素A棕櫚酸酯對照品、維生素D3對照品和維生素E對照品各適量，用無水乙醇制成每1 mL中約含維生素A棕櫚酸酯1000 U、維生素D3 100 U、維生素E 3 U的溶液，濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品1 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 精密吸取20 μL空白溶劑、陰性溶液(不含主藥)、對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件，注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示，空白溶劑及陰性溶液對三種組分含量測定無干擾。

(a：空白溶劑圖譜；b：陰性溶液圖譜；c：對照品圖譜；d：供試品圖譜)

2.3.2 線性 精密稱定維生素A棕櫚酸酯、維生素D3、維生素E對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL中含維生素A棕櫚酸酯6096 μg、維生素D3 256 μg、維生素E 30023 μg的混合液，精密量取上述對照品混合液0.1、0.2、0.6、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。按上述色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以樣品濃度為x(μg/mL)，平均峰面積為y，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果回歸方程(n=7)和相關(guān)系數(shù)分別為維生素Ay=7.3235x+24.297，r2=1；維生素D3y=4.5714x+0.77738，r2=0.99995；維生素Ey=1.2036x+33.179，r2=0.9999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維生素A、維生素D3和維生素E分別在60.96～1219.20 μg/mL、2.56～51.20 μg/mL和300.23～6004.60 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 準(zhǔn)確度 精密量取對照品溶液40 mL、50 mL和60 mL各3份分別置100 mL量瓶中，再分別精密量取0.50 mL供試品加入至上述各100 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，即得樣品溶液。供試品溶液作為本底溶液。按上述色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果如表2，平均回收率大于99%，說明檢測方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 準(zhǔn)確度結(jié)果

2.3.4 精密度

2.3.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份供試品，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中三種維生素的含量，結(jié)果如表3，RSD均小于1.0%，說明重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性結(jié)果

2.3.4.2 中間精密度 由A、B、C三人，分別取2份供試品，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中三種維生素的含量，結(jié)果如表4，RSD均小于0.5%，說明精密度良好。

表4 中間精密度結(jié)果

2.3.5 穩(wěn)定性 取1份供試品，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣20 μL，測定供試品溶液中三種維生素的含量， 結(jié)果如表5，RSD均小于1.0%，說明制備后12小時內(nèi)測定基本穩(wěn)定。

2.3.6 耐用性 考察不同的流動相、柱溫和流速對含量測定的影響，按上述色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果如表6，在流動相、柱溫和流速出現(xiàn)小的變動時，含量測定基本不受影響。

表5 穩(wěn)定性結(jié)果(n=4)

表6 耐用性-流動相、柱溫、流速結(jié)果

3 討 論

3.1 檢測方法的選擇 截止到目前，維生素的分析方法主要包含微生物法、生物鑒定法、化學(xué)法和儀器法四大類[6]，其中微生物法僅用于測定水溶性維生素的含量，生物鑒定法用于分析樣品生物利用率，化學(xué)法用于特定維生素的檢測，儀器法用途較為廣泛。隨著科技的不斷發(fā)展，高效液相色譜法已逐步成為常規(guī)的含量檢測手段，該方法具有快速、靈敏等特點(diǎn)[7]。本文研究的HPLC法能夠在40 min內(nèi)，有效分離維生素A、維生素D3和維生素E，滿足了實(shí)際生產(chǎn)過程中對檢驗(yàn)時間及結(jié)果的需求。

3.2 提取方式的選擇 目前，脂溶性維生素的提取方式主要以皂化法為主，通過皂化法處理樣品，水洗去除類脂物后，用有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素，濃縮后將樣品溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行測定[8]。在整個提取過程中，為了避免維生素的氧化降解，通常采用加入抗氧劑、充氮?dú)夂捅芄獾确椒ㄟM(jìn)行操作。由此可見，采用皂化法進(jìn)行脂溶性維生素的預(yù)處理，是較為繁瑣的過程，同時整個過程中容易出現(xiàn)提取不完全的現(xiàn)象，并且過程的復(fù)雜性對含量結(jié)果的準(zhǔn)確度具有很大影響，因此選擇更簡單、快速的提取方式，是進(jìn)行脂溶性維生素檢測所需要關(guān)注的重點(diǎn)方向。根據(jù)維生素A、維生素D3和維生素E均溶于乙醇的物理特性，結(jié)合相似相溶原理，采用無水乙醇直接提取的方法進(jìn)行含量測定，通過方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果說明該提取方法是可行的。

3.3 檢測波長的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報道，結(jié)合實(shí)際紫外可見全波段掃描發(fā)現(xiàn)，維生素A、維生素D3、維生素E的最大吸收波長分別為325 nm、265 nm和290 nm[9]，樣品中維生素D3的占比較小，而且在265 nm波長處維生素A和維生素E具有較好吸收。因此，選擇265 nm吸收波長作為檢測波長[10-11]，既降低了對檢測器的要求，擴(kuò)大了方法的適用性，又滿足了三種維生素的檢測靈敏度要求，最終達(dá)到了簡化檢測方法的目的。

3.4 流動相的選擇 采用HPLC法檢測脂溶性維生素常用的流動相有甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇和水等組成[12-14]。本研究先后采用甲醇-水、乙腈-乙醇-水和梯度洗脫等方式，發(fā)現(xiàn)以甲醇為流動相A，乙腈-乙醇-水(60∶25∶5)為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫時，維生素A、維生素D3和維生素E能有效分離、峰型對稱、無干擾，并且通過方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果說明該流動相是合適的。

4 結(jié) 論

HPLC法測定維生素ADE注射液中維生素A、維生素D3和維生素E含量方法可行，供試品溶液三個主峰的保留時間與對照品相應(yīng)三個主峰的保留時間一致，樣品分離效果較好，有很好的專屬性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性和耐用性。