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(1.成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106；2.成都大學 四川抗菌素工業(yè)研究所, 四川 成都 610052)

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本植物，其根莖和根是一種較為稀缺的中藥材[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，紅景天藥材具有抗缺氧、抗氧化、抗微波輻射、抗衰老、抗心律失常以及治療高原紅細胞增多癥的功效，另外還有抗病毒、抗癌和保肝等方面作用[2-4]；目前研究還發(fā)現(xiàn)，紅景天植物中所含有的紅景天苷不僅能有效地抑制 SH-SY 5 Y 細胞凋亡,還可對神經(jīng)細胞起到保護作用[5]。

紅景天植物在我國有73種2亞種7變種，大多生長于高寒、缺氧和紫外線照射強、晝夜溫差大、海拔2 000～5 000 m的巖石縫隙和高山礫石中[6]；紅景天植物既是重要的中藥材來源植物，又是治理土壤沙漠化的重要經(jīng)濟樹種[7]。

本實驗選擇大花紅景天、長鞭紅景天和狹葉紅景天的根與根狀莖為材料，研究了3種紅景天植物的石蠟切片制作方法，并進一步比較了3種紅景天植物石蠟切片的顯微組織結構特點。

1 材料、儀器和試劑

1.1 材 料

實驗材料狹葉紅景天、大花紅景天和長鞭紅景天取自阿壩藏族羌族自治州紅原縣。

1.2 試驗儀器與試劑

主要儀器:KD-2508型轉輪式石蠟切片機(上海之信儀器有限公司)、Eclipse 50i尼康顯微鏡、SMZ 161體式顯微鏡、QSGW恒溫箱(上海慶聲試驗儀器設備有限公司)和BN-518生物組織自動包埋機(湖北伯納醫(yī)療科技有限公司)。

主要試劑：冰醋酸、酒精、1%番紅水溶液(水配制)、1%固綠酒精溶液(水配制)、二甲苯和石蠟以及FAA 固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)。

2 試驗方法與步驟

2.1 材料處理

將3種紅景天根和根狀莖分別洗凈擦干后，迅速橫切成2 mm厚的圓片。

2.2 固 定

將處理好的材料放入瓶中，加入材料體積15～20倍的FAA 固定液，分別放置在室溫下固定8，12 h和16 h后，用75%乙醇震蕩洗滌去除固定液。

2.3 脫水與透明

將固定后的材料依次放入75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇(Ⅰ)→95%乙醇(Ⅱ)→無水乙醇(Ⅰ)→無水乙醇(Ⅱ)的不同濃度溶液中,分別進行1 h的脫水處理后，再依次放入(1/2無水乙醇+1/2二甲苯)→(1/5無水乙醇 +4/5二甲苯100%)→二甲苯100%(Ⅰ)→二甲苯100%(Ⅱ)中進行各 1 h的材料透明處理。

2.4 浸蠟與包埋

在65 ℃的恒溫條件下，將透明后的材料放入1/2二甲苯+1/2石蠟溶液中進行1 h的浸蠟處理后，再轉入100%石蠟液中處理1 h，接著將材料再換入100%石蠟液中進行1 h的浸蠟處理，最后用包埋機包埋材料。

2.5 修片和切片

將石蠟包埋的材料修成矩形，放在切片機上切片。

2.6 黏 片

在黏片前，先用滴管將純水做成凸起來的水條，再將蠟帶輕輕放上去，并用濾紙吸取多余水分，最后將制得的裝片放在75 ℃恒溫箱中烘烤至石蠟融化。

2.7 脫 蠟

將制作的裝片放在65 ℃恒溫箱中烘干后，再依次放入100%二甲苯(1.5 h/次,共2次)→1/2二甲苯+1/2無水酒精溶液(1.5 h/次,共2次)→100%酒精(1.5 h/次,共2次)→蒸餾水(1 h/次,共2次)中進行脫蠟。

2.8 染色與封片

先用1%的番紅水溶液染色20 min后,用蒸餾水洗滌3～5次；再用1%的固綠染色30 s后,將裝片浸泡在75%的乙醇溶液中1 min后取出晾干[8]，最后再加樹膠于材料表面蓋上蓋玻片。

3 結果與討論

3.1 不同固定時間對切片和染色效果的影響

固定液能快速的殺死細胞并保持細胞的原有形態(tài)，以便于切片后能全部清楚地觀察到細胞內(nèi)的各種結構。本實驗以大花紅景天植物的根狀莖和根為材料，采用FAA 為固定液，并設計了不同固定時間，結果見表1。

表1 不同固定時間對大花紅景天切片和染色效果的影響

編號固定時間(h) 大花紅景天根狀莖 大花紅景天根 切片效果染色效果切片效果染色效果A18較差好較好好A212好好好好A316好差好差

從表1可以看出，A 2的大花紅景天根和根狀莖材料固定了12 h，其切片效果和染色效果都好，具體表現(xiàn)為切片成蠟帶狀、平整且無缺損，并且各切片的染色效果也好,各部分組織細胞著色明顯(見圖1和圖2)，這是因為采用適宜的固定時間能將植物組織材料硬化到適中的程度，并且還可增加植物組織細胞中的折光度。當A 1材料固定8 h時，其根和根狀莖切片的染色效果也都好，各部分組織細胞著色明顯；但切片效果均比固定12 h的差，具體為大花紅景天的根切片的蠟帶有少量卷曲，而根狀莖切片的蠟帶大部分呈現(xiàn)出卷曲。當A 3材料固定16 h時，其大花紅景天根和根狀莖的切片效果都好，切片成蠟帶狀、平整且無缺損，但切片的染色效果不好，表現(xiàn)為各部分組織細胞著色不明顯。

由此可見，在石蠟切片的制作過程中，切片的材料采用不同的固定時間會明顯影響到切片材料的硬化程度，并對后續(xù)切片細胞的染色都有明顯的影響，這與喬秀玲等[9]的研究結論一致。

3.2 不同脫水過程對大花紅景天根狀莖切片制作的影響

以大花紅景天根狀莖為材料，研究不同脫水過程對其石蠟切片制作的影響，結果見表2。

從表2可看出，按B 1的脫水過程處理材料，切出的蠟片卷曲嚴重并無法展平；按B 2的脫水過程處理材料，切出的蠟片有卷曲并且蠟片還有一定損傷不太完整；按B 3的脫水過程處理材料，蠟片切片的效果好，切出的蠟片呈現(xiàn)為完整蠟帶，且蠟帶平整無缺損；最后按B 4的脫水過程共進行8 h的脫水處理，其石蠟切片的最終效果不好，這主要是因為材料經(jīng)過長時間的脫水會變得非常的硬脆，以至于在最后的切片過程中材料破壞非常嚴重，不能切出完整的蠟片。

表2 不同脫水過程對大花紅景天根狀莖切片效果的影響

編號脫水過程切片效果 B175%乙醇1h→80%乙醇1h→85%乙醇1h→90%乙醇1h→95%乙醇30min→無水乙醇(Ⅰ)30min→無水乙醇(Ⅱ)30min切片卷曲嚴重,無法展平。B275%乙醇1h→80%乙醇1h→85%乙醇1h→95%乙醇(Ⅰ)30min →95%乙醇(Ⅱ)30min→無水乙醇(Ⅰ)1h→無水乙醇(Ⅱ)1h 切片卷曲、有損傷,不成平整蠟帶。B375%乙醇1h→85%乙醇1h→95%乙醇(Ⅰ)1h→95%乙醇(Ⅱ)1h→無水乙醇(Ⅰ)1h→無水乙醇(Ⅱ)1h切片為完整蠟帶狀、平整無缺損。B4 75%乙醇1h→80%乙醇1h→85%乙醇1h→90%乙醇1h→95%乙醇(Ⅰ)1h→95%乙醇(Ⅱ)1h→無水乙醇(Ⅰ)1h→無水乙醇(Ⅱ)1h切片破碎嚴重。

注：a為木栓層；b為形成層；c為紅景天髓內(nèi)異型微管束；c1為紅景天髓內(nèi)異型微管束外側；c2為紅景天髓內(nèi)異型微管束內(nèi)側；d為木栓組織環(huán)。圖1 大花紅景天根 圖2 大花紅景天根狀莖 圖3 長鞭紅景天根狀莖 圖4 狹葉紅景天根狀莖

由此可見，在石蠟切片的制作過程中，脫水時間是影響制片效果的關鍵因素。如材料脫水時間過短則會導致材料脫水不徹底，對后續(xù)浸蠟、切片和染色等步驟都會有影響；但如脫水時間過長，又會導致細胞脫水嚴重，其結構萎縮改變很大，使得制作的切片破碎嚴重且結構失真。王耀文等[10]在對山藥的石蠟切片制作過程中，篩選出的最佳脫水過程為70%乙醇(2 h)→95%乙醇(2 h)→95%乙醇(過夜)→無水乙醇Ⅰ(2 h)→無水乙醇Ⅱ(2 h)。由此可見，使用不同材料制作石蠟切片，其具體采用的脫水時間必須根據(jù)制作材料的特點而進行相應的調整。

3.3 3種紅景天根狀莖石蠟切片的顯微結構比較

選擇上述大花紅景天根狀莖切片制作過程中的最佳固定和脫水過程，對狹葉紅景天和長鞭紅景天的根狀莖也進行石蠟切片制作，并在顯微鏡下觀察了3種紅景天根狀莖的切片, 進一步從解剖學上比較了3種紅景天根狀莖組織結構(結果見表3)。

表3 3種紅景天根狀莖的組織結構特征比較

種類木栓層層數(shù)髓部異常維管束木栓組織環(huán)形成層是否明顯大花紅景天根狀莖2～3內(nèi)、外2層無明顯長鞭紅景天根狀莖8～121層無不明顯狹葉紅景天根狀莖7～121層有明顯

通過由外到內(nèi)觀察(圖2、圖3、圖4)3種紅景天根狀莖的石蠟切片的組織結構特點可以看出，大花紅景天的木栓層較薄，僅2～3層，而狹葉紅景天和長鞭紅景天木栓層都較厚，均在7～8層以上；另外，還觀察發(fā)現(xiàn)只有在狹葉紅景天根狀莖的皮層組織中有木栓組織環(huán)的結構存在。從對3種紅景天根狀莖的橫切面觀察發(fā)現(xiàn)，大花紅景天和狹葉紅景天其根狀莖的形成層結構比較明顯，而長鞭紅景天根狀莖的形成層結構就不明顯；進一步觀察3種紅景天根狀莖的髓部都可以發(fā)現(xiàn)有異常維管束的存在，分別表現(xiàn)為大花紅景天的髓部異常維管束比較明顯排列為2圈，長鞭紅景天和狹葉紅景天髓部異常維管束只排列為1圈，但長鞭紅景天的髓部異常維管束形態(tài)不太明顯。

4 結論與討論

顯微制作技術最簡單的操作方法是徒手切片，但由于許多動、植物的組織軟硬程度往往不太適中，所以切削很困難，也無法得到十分菲薄的切片；因此，必須先將材料經(jīng)過一系列特殊處理，如固定、脫水、包埋、切片以及染色等十分繁鎖的處理過程；并且，在石蠟切片的具體制作過程中，不同的材料所采取的制作方法也不完全相同，而必須要根據(jù)各種材料的特性進行合理選擇。

石蠟切片是一項極具實際操作價值和意義的技術手段[11]，盡管石蠟切片法工序繁瑣、技術復雜，但它最能準確地展示生物體各細胞組織間正常結構位置關系，并能很好地和長時間地保留各組織細胞的原貌，所以目前仍然是光學顯微鏡的主要制片方法。