林鄭和，鐘秋生，游小妹，陳志輝，陳常頌，單睿陽，阮其春

?

低溫脅迫對茶樹抗氧化酶活性的影響

林鄭和，鐘秋生，游小妹，陳志輝，陳常頌*，單睿陽，阮其春

福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015

以白雞冠F1代新品系（0306I、0306F、0306D）及黃旦的扦插苗為試驗材料，測定低溫（0℃）脅迫下茶樹抗氧化酶活性的變化。結果表明，低溫下各品種（系）葉片電導率、過氧化氫及丙二醛含量都顯著增加，其中0306F與0306D增加幅度明顯大于黃旦與0306I；谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）與超氧化物岐化酶（SOD）活性都顯著增加，其中黃旦與0306I低溫下GR、APX、POD、SOD增加幅度遠大于品系0306D與0306F。低溫下單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸（ASC）與谷胱甘肽（GSH）活性顯著下降，其中0306F與0306D品系葉片的MDAR與CAT低溫下下降幅度遠大于黃旦與0306I?；貧w分析發(fā)現(xiàn)，葉片雙氧水含量與APX（=601.8-59.1）及CAT（=5.45-0.77）活性呈負相關，電導率與ASC（=7.45-10.35）也呈負線性相關。以上結果表明，茶樹品種（系）0306F與0306D抗寒性弱于0306I與黃旦。

低溫；茶樹；活性氧；代謝

在全球氣候變暖的趨勢下，低溫是影響茶樹生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境因子之一。近年來氣候變化異常，春季倒春寒出現(xiàn)頻繁。在中國的南方，特別在福建、廣東、浙江等地，春季茶園經(jīng)常遭受倒春寒襲擊，嫩梢遭受寒害，大面積茶園減產(chǎn)，甚至春茶顆粒無收，嚴重時導致茶樹直接死亡，嚴重影響了茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

選用抗寒性強的品種，是防止茶樹寒害最有效的措施之一；研究茶樹適應低溫脅迫的生理機制，有利于保護其免受寒害。低溫直接或間接影響茶樹葉綠體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)平衡[1]，如超氧陰離子（O-2）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等。植物為了保護其細胞免受過量ROS的傷害，發(fā)展了一套完整的防御系統(tǒng)，包括酶促的抗氧化體系和非酶促抗氧化體系[2-3]。酶促抗氧化體系中重要的氧化酶有超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）等；非酶促抗氧化體系重要的有抗壞血酸（ASC）、谷胱甘肽（GSH）等[4]。研究表明，低溫脅迫下植物葉綠體積累大量的活性氧（ROS），使得葉綠體膜受到破壞，但活性氧過度積累會觸發(fā)葉綠體內(nèi)活性氧酶促進清除系統(tǒng)，從而有效地清除葉綠體內(nèi)積累的活性氧，保護葉綠體膜結構的完整性[5]。有研究表明，活性氧的清除與植物品種抗性強弱密切相關[6-7]，植物的抗氧化系統(tǒng)與其低溫傷害密切相關[8-9]，抗寒性強的品種抗氧化酶活性往往高于抗寒性弱的品種，隨脅迫時間延長，保護酶活性下降，抗寒性強的品種下降幅度較小，積累起來的活性氧能引發(fā)并加劇細胞膜脂過氧化，從而造成膜系統(tǒng)損傷嚴重[8]，這些在藍莓[10]、咖啡[11]、玉米[12]、水稻[13]、苜蓿[14]、黃瓜[15]等植物上已有報道。而茶樹關于這方面報道并不多[16-17]。目前，逆境中觀察茶樹生理生化指標的變化，比較不同茶樹品種抗逆性指標差異仍是茶樹抗性篩選與鑒定的重要手段之一。0306D、0306F和0306I是從白雞冠天然雜交后代中選育出的新品系，它們的葉色黃白，灌木型，中葉類，前期田間觀測發(fā)現(xiàn)特別容易受到寒害。受凍時，芽梢葉色由黃白變暗，最終葉色類似燒焦?；诖耍狙芯恳?306D、0306F、0306I與黃旦為試驗材料，測定低溫下活性氧各相關生理指標的變化，以期為茶樹抗寒性鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及低溫處理

選用白雞冠天然雜交后代新品系0306D、0306F、0306I與黃旦植株大小、生長高度（15~17?cm）一致的扦插苗（10個月齡）為試驗材料，根系裹著泥土。將每個品種（系）分為2組，放入智能人工氣候箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）中，一組放置在正常溫度（28℃）下生長，另一組進行低溫（0℃）脅迫處理，兩組光照強度和光照時間都相同，分別為300?μmol·m-2·s-1和12?h·d-1。在處理24?h后，從各處理取代表性葉片（從上往下數(shù)第4-5片葉），采后立即用打孔器取圓片（每圓片面積約0.608?cm2），然后放入液氮迅速冷凍，后轉移到-80℃低溫冰箱中貯藏，供測定光合色素與活性氧代謝酶各項指標用。

1.2 葉綠素與蛋白質含量的測定

葉綠素的檢測參照Lichtenthaler等[18]的方法。稱取各處理下的茶樹新品種（系）的圓葉片3個（面積：3×0.608?cm2），剪碎，加入8?mL 80%的丙酮，置于陰暗處，48?h后，取上清液于663、645、440?nm處測定吸光度值，并計算葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量。蛋白質含量的測定用考馬斯亮藍G-250染色法[19]。

1.3 抗氧化酶活性測定

取3個圓葉片，放到預冷的研缽中，加2?mL提取液緩沖液［50?mmol·L-1KH2PO4-KOH（pH 7.5），1?mmmol·L-1EDTA，0.5%（w/v）曲拉通 X-100，5%（w/v）不溶性PVPP］，在冰浴中研磨成勻漿，勻漿用冰凍離心機15?000?g下離心10?min，上清液用于酶活性測定[20]?？箟难徇^氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定按Chen等[21]與林鄭和[22]的方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定，具體參照林鄭和等[3]的方法測定。

1.4 生理指標的測定

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定，具體參照Hodges等[23]的方法進行。還原型谷胱甘肽（GSH）和抗壞血酸（ASC）含量測定按照Chen等[21]的方法進行。過氧化氫（H2O2）測定參照Chen等[20]，相對電導率測定參照蔣家月等[16]的方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)作差異顯著性分析，試驗均重復4次（不同植株為1重復）。

2 結果與分析

2.1 低溫對新品系葉綠素與蛋白質含量的影響

從表1可看出，低溫脅迫降低了茶樹葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量的含量，而使得蛋白質含量增加。低溫下0306D品系的葉綠素a與總葉綠素含量下降幅度最大（相對比值為0.67與0.73），低溫下0306F與0306D蛋白質增幅略高于黃旦與0306I。

2.2 低溫對茶樹葉片相對電導率、過氧化氫及丙二醛含量的影響

圖1可看出，低溫下各品種（系）葉片相對電導率（圖1-A）、過氧化氫（圖1-B）及丙二醛（圖1-C）含量都顯著增加，其中0306F與0306D增加幅度明顯大于黃旦與0306I。

表1 低溫對茶樹葉片葉綠素與蛋白質含量的影響

注：以上數(shù)值為4次重復的平均值±標準誤，同列中字母不同者差異顯著（<0.05）。括號中的數(shù)值為：低溫與對照的比值。

Note: Data are presented as means ± standard errors (n = 4). Within a column, values followed by different letters are significantly different at< 0.05. The value in parentheses is the ratio of low temperature/control.

不同茶樹新品種（系）

Different tea varieties (lines)

注：每一點為4次重復的平均值±標準誤，字母不同者差異顯著（<0.05）。

Note: Data are presented as means ± standard errors (n = 4). Different letters indicate a significant difference at< 0.05.

圖1 低溫對茶樹葉片相對電導率（A）、丙二醛（B）與過氧化氫（C）含量的影響

Fig. 1 Effects of low temperature on relative conductivities (A), MDA content (B) and H2O2(C) inleaves of new tea varieties

2.3 低溫對茶樹葉片抗氧化系統(tǒng)各酶活性的影響

從圖2看出，低溫下茶樹葉片GR（圖2-A與圖2-B）、APX（圖2-C與圖2-D）、POD（圖2-E與圖2-F）、SOD（圖2-G與圖2-H）活性都顯著增加，用單位面積蛋白質表示也是得出同樣的結果。其中黃旦與0306I品系低溫下GR、APX、POD、SOD增加幅度遠大于品系0306D與0306F。低溫下MDAR（圖3-A）、DHAR（圖3-C）、CAT（圖3-E）活性顯著下降，其中0306F與0306D品系葉片的MDAR與CAT低溫下下降幅度遠大于黃旦與0306I，用單位面積表示活性時，也發(fā)現(xiàn)0306D與0306F品系葉片低溫下MDAR（圖3-B）、DHAR（圖3-D）、CAT（圖3-F）活性下降得更為明顯。

2.4 低溫對茶樹葉片ASC與GSH含量的影響

從圖4看出，低溫下ASC（圖4-A）與GSH（圖4-B）的含量顯著降低，其中品系0306D與0306F下降幅度遠大于品系0306I與黃旦。

2.5 葉片過氧化氫含量、電導率與抗氧化酶活性的線性關系

通過回歸分析，發(fā)現(xiàn)葉片過氧化氫含量與APX（=601.8-59.1,2=0.9516，=0.01）及CAT (=5.45-0.77,2=0.9728，=0.007) 活性呈負線性相關，電導率與ASC (=7.45-10.35,2=0.9062，=0.02) 也呈負線性相關。其他的抗氧化酶線性關系不明顯。

不同茶樹新品種（系）

Different tea varieties(lines)

注：每一點為4次重復的平均值±標準誤，同一點標準誤上（下）字母不同者差異顯著（<0.05）。

Note: Data are presented as means ± standard errors (n = 4). Different letters indicate a significant difference at< 0.05

圖2 低溫對茶樹葉片GR（A與B）、APX（C與D）、POD（E與F）、SOD（G與H）活性的影響

Fig. 2 Effects of low temperature on GR (A and B), APX (C and D), POD (E and F) and SOD activities (G and H) in new tea varieties

注：每一點為4次重復的平均值±標準誤，字母不同者差異顯著（P<0.05)。

注：每一點為4次重復的平均值±標準誤，字母不同者差異顯著（P<0.05）。

圖5 相對電導率、過氧化氫與APX、CAT、ASC線性關系

3 討論與結論

低溫受凍是目前我國茶園減產(chǎn)的重要原因之一[24]。植物自身抗寒性的強弱與其固有的抗氧化能力有著直接的關聯(lián)[16]，抗寒性強的物種低溫下通過增強抗氧化酶活性清除過剩的自由基，防止膜質過氧化，降低了細胞內(nèi)膜系統(tǒng)的破壞程度[8]。本研究表明，低溫脅迫下4個新品種（系）電導率都顯著增加，說明茶樹細胞膜受到傷害進而發(fā)生膜脂過氧化作用，膜透性增大，膜內(nèi)的可溶性物質即電解質大量滲出，相對電導率增大。而0306F與0306D低溫下電導率增加尤為顯著，說明抗凍能力差，這與孫富等[5]在甘蔗上不抗寒品種ROC22得出的結果相類似。低溫下4個新品種（系）葉綠體內(nèi)MDA、H2O2與電導率含量增加，說明茶樹葉綠體內(nèi)的ROS大量積累，使葉綠體膜有可能受到傷害。這在烤煙[25-26]、番茄[27]、茄子[28]低溫下相類似。有研究表明，SOD、POD、CAT、GR、APX等協(xié)調作用，共同組成植物主要的保護酶，清除植物體內(nèi)ROS，提高植物對脅迫的適應性[8,27]。有研究表明，SOD可以將O-2歧化成H2O2，再由POD、CAT、APX、GR等酶來完成清除，從而緩解ROS的傷害[29]。本研究表明，低溫下SOD、POD顯著增加，CAT卻下降，但是發(fā)現(xiàn)新品系0306F、0306D增加的幅度很小，下降的幅度卻很大，說明新品系0306F與0306D葉片中的葉綠體內(nèi)ROS相對過剩，未能及時清除，導致細胞膜受傷害較大，說明抗寒性較弱。CAT是一種含血紅素的四聚體蛋白，其作用是分解光呼吸中產(chǎn)生的H2O2[3,30]，低溫脅迫下，蛋白質合成受抑，CAT因失活而大大降低[3]。但是也有研究表明，低溫逆境下CAT活性與品種的抗寒性沒有直接關系，但抗寒性強的品種中CAT能保持較穩(wěn)定的活性，從而行使其分解H2O2的功能[8]。

植物體內(nèi)清除H2O2、MDA等并不完全由CAT、POD、SOD等進行，另外還有一套完整的防御系統(tǒng)即非酶促抗氧化體系。其中抗壞血酸-谷胱甘肽（ASC-GSH）循環(huán)在清除活性氧過程中發(fā)揮著極其重要的作用[31]?？箟难徇^氧化酶（APX）是葉綠體中清除H2O2的重要酶，以抗壞血酸（AsA）為底物將H2O2還原成H2O，同時生成單脫氫抗壞血酸（MDHA）和脫氫抗壞血酸（DHA），MDHA和DHA在MDAR和DHAR作用下再生成抗壞血酸（AsA）。本研究表明，低溫下APX表現(xiàn)非常敏感，增加顯著，其中黃旦與0306I尤為明顯，可能是H2O2過多的累積[32]。本研究還發(fā)現(xiàn)，茶樹葉片中APX活性一直高于DHAR活性，說明APX氧化AsA的活性比DHAR再生AsA的活性強，說明APX是清除H2O2的重要酶。

GSH含量及GR活性水平被認為是植物抗氧化狀態(tài)的重要標志[27]。GR的活性與GSH含量有密切相關，GR最后一步將GSSG還原為GSH。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫下GR活性顯著增加，其中黃旦與0306I增加尤為明顯，而GSH含量低溫下0306F與0306D下降更為明顯，說明低溫下黃旦與0306I品種（系）較為更有效的合成GSH，清除H2O2。高GR活性可使細胞GSH維持在高濃度狀態(tài), 這在水稻上也有相一致的報到[33]。上述結果說明低溫下0306I與黃旦抗氧化體系上調幅度明顯大于0306F與0306D，茶樹品種（系）0306I與黃旦抗寒性強于0306F與0306D。

[1] 宋祥春, 趙惠新, 苗玉青, 等. 低溫對兩種沙冬青幼苗光合生理指標的影響[J]. 新疆大學學報(理工版), 2009, 26(3): 342-346.

[2] Pieters A J, Paul M J, Lawlor D W. Low sink demands limits photosynthesis under Pi deficiency [J]. Journal of Experimental Botany, 2001, 52: 1083-1091.

[3] Lin Z H, Chen L S, ChenR B, et al. Antioxidant system of tea () leaves in response tophosphorus supply [J]. Acta Physiologiae Plantarum,2012, 34: 2443-2448.

[4] Horling F, Lamkemeyer P, Konnig J, et al. Divergent light-, ascorbate-, and oxidative stress-dependent regulation of expression of the peroxiredoxin gene family in Arabidopsis [J]. Plant Physiology, 2003, 131: 317-325.

[5] 孫富, 楊麗濤, 謝曉娜, 等. 低溫脅迫對不同抗寒性甘蔗品種幼苗葉綠體生理代謝的影響[J]. 作物學報, 2012, 38(4): 732-739.

[6] Chen L J, Xiang H Z, Miao Y. An over view of cold resistance in plants [J]. Journal of Agronomy and Crop Science, 2014, 200: 237-245.

[7] 黃建安. 茶樹保護性酶類與抗寒性的關系[J]. 茶葉科學, 1990, 10（1）: 35-40.

[8] 田景花, 王紅霞, 張志華, 等. 低溫逆境對不同核桃品種抗氧化系統(tǒng)及超微結構的影響[J]. 應用生態(tài)學報, 2015, 26(5): 1320-1326.

[9] 崔搖翠, 王利鵑, 周清元, 等. 低溫脅迫下烤煙幼苗葉片光合作用和抗氧化能力基因差異表達譜[J]. 生態(tài)學報, 2014, 34(21): 6076-6089.

[10] Liu W P, Su S C, Liu X. Comparison of different cultivars of blueberry over wintering ability in Qingdao of China [J]. American Journal of Plant Science, 2012, 3: 391-396.

[11] Fortunato A S, Lidon F C, Batista-Santos P. Biochemical and molecular characterization of the antioxidative system of coffea SP. under cold conditions in genotypes with contrasting tolerance [J]. Journal of plant Physiology, 2009, 167: 333-342.

[12] Taka T.The relationship of antioxidant enzymes and some physiological parameters in maize during chilling [J]. Plant Soil Environment, 2004, 50: 27-32.

[13] Huang M, Guo Z. Responses of antioxidative system to chilling stress in two rice cultivars differing in sensitivity [J]. Biology Plant, 2005, 49: 81-84.

[14] Wang W B, Kim Y H, Lee H S, et al. Differential antioxidation activities in two alfalfa cultivars under chilling stress [J]. Plant Biotechnology Reports, 2009, 3(4): 301-307.

[15] Kang H M, Saltveit M E. Reduced chilling tolerance in elongating cucumber seedling radicles is related to their reduced antioxidant enzyme and DPPH-radical scavenging activity [J]. Plant Physiology 2002, 115:244-250.

[16] 蔣家月, 金鳳玲, 王蕓芳, 等.冬季自然低溫脅迫對茶樹抗寒生理指標的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報, 2012, 39(3): 394-396.

[17] 李葉云, 舒錫婷, 周月琴, 等. 自然越冬過程中3 個茶樹品種的生理特性變化及抗寒性評價[J].植物資源與環(huán)境學報, 2014, 23(3): 52-58.

[18] Lichtenthaler, H K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes [J] . Methods Enzymol, 1987, 148: 350-382.

[19] Bradford M M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J] . Anal Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[20] Chen L S, Qi Y P, Liu X H. Effects of aluminum on light energy utilization and photoprotective systems in citrus leaves [J]. Annals of Botany 2005, 96: 35-41.

[21] Chen L S, Cheng L. Both xanthophyll cycle-dependent thermal dissipation and the antioxidant system are up-regulated in grape (Vitis labrusca L. cv. Concord) leaves in response to N limitation [J] . Journal of Experimental Botany, 2003, 54(390): 2165-2175.

[22] 林鄭和. 茶樹對缺磷的生理生化反應與適應[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學, 2009.

[23] Hodges D M, DeLong J M, Forney C F. Improving the thiobarbituric acid-reactive- substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds [J] . Planta, 1999, 207: 604-611.

[24] 孫海偉, 曹德航, 尚濤, 等. 茶樹抗寒育種及轉基因研究進展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學, 2013, 45(6): 119-122.

[25] 郭瑞, 曾榕, 張金鑫, 等. 低溫后不同光強對烤煙幼苗葉片活性氧代謝和葉綠素熒光參數(shù)的影響[J]. 華北農(nóng)學報2015, 30 (增刊1) : 225 -230.

[26] 邵怡若, 許建新, 薛搖立, 等. 低溫脅迫時間對4種幼苗生理生化及光合特性的影響[J]. 生態(tài)學報, 2013, 33(14): 4237-4247.

[27] 劉玉鳳, 李天來, 高曉倩. 夜間低溫脅迫對番茄葉片活性氧代謝及AsA-GSH 循環(huán)的影響[J]. 西北植物學報, 2011, 31(4): 707-714.

[28] 陳磊, 郭軍, 田時炳, 等. 低溫弱光脅迫對不同茄子品種幼苗抗氧化特性的影響. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2012, 25(6): 2054-2058.

[29] 李天來, 高曉倩, 劉玉鳳. 夜間低溫脅迫下鈣對番茄幼苗根系活力及活性氧代謝的調控作用[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報, 2011, 20(8): 127-132.

[30] Willekens H, Inzé D, van Montagu M. Catalase in plants [J]. Mol Breeding 1995(1): 207-228.

[31] 楊寧, 丁芳霞, 李宜珅, 等. 低溫脅迫對高山離子芥試管苗膜脂過氧化及AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的影響[J]. 西北師范大學學報(自然科學版), 2014, 50(5): 79-82.

[32] Foyer C H, Noctor G. Redox sensing and signaling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria [J]. Physiologia Plantarum, 2003, 119: 355-364.

[33] Uchida A, Jagendorf AT, Hibino T, et al. Effect s of hydrogen peroxide and nitric oxide on both salt and heat stress tolerance in rice [J]. Plant Science, 2002, 163: 515-523.

Antioxidant Enzyme Activity of Tea Plant () in Response to Low Temperature Stress

LIN Zhenghe, ZHONG Qiusheng, YOU Xiaomei, CHEN Zhihui, CHEN Changsong*, SHAN Ruiyang, RUAN Qichun

Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu'an 355015, China

New clonal tea varieties 0306D, 0306F, 0306I from F1 population of Baijiguan and Huangdan were employed as test materials. Antioxidant enzyme activities of tea plants under low temperature were measured. The results showed that leaves under low temperature had higher conductivity, malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) contents with the increasing ratios higher in 0306D and 0306F than 0306I and Huangdan. The increasing ratios of peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX) and glutathione reductase (GR) activities of the Huangdan and 0306I tea varieties were higher than 0306D and 0306F. While monodehydroascorbate reductase (MDAR), dehydroascorbate reductase (DHAR), ascorbate (ASC), reduced glutathione (GSH) and catalase (CAT) activities of 0306D and 0306F were less decreased than 0306I and Huangdan. The results indicated that higher activities of defense enzymes and higher antioxidant content in 0306I and Huangdan under stress were associated with chilling tolerance.Further regression analysis showed that the H2O2content was negatively correlated with APX and CAT, and conductivity was negatively correlated with ASC content. The above results indicated that the tolerance to low temperature in 0306I and Huangdan was stronger than 0306F and 0306D.

low temperature, tea plant, active oxygen, metabolism

S571.1；S233.75

A

1000-369X(2018)04-363-09

2018-02-27

2018-04-17

國家自然科學基金（31570690）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術體系（nycytx-23）、福建省公益科研院所專項（2015R1012-4; 2015R1012-10）、福建省自然科學基金（2016J01119）、院青年創(chuàng)新團隊（STIT2017-2-13）

林鄭和，男，博士，副研究員，主要從事茶樹遺傳育種與生理生化。*通訊作者