李 茜，曾倩倩，劉 慧，向 紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)超聲科，新疆 烏魯木齊 830054)

卵巢腫瘤早期診斷困難，患者預(yù)后差?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(metalloproteinase-2, MMP-2)在人卵巢癌血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)結(jié)構(gòu)中有特異性表達(dá)[1-2]，且其過表達(dá)與卵巢腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3]。目前關(guān)于靶向CEUS與MMP-2相關(guān)性的研究較少。本研究通過靶向CEUS檢測不同時期卵巢癌時間強(qiáng)度曲線(time intensity curve, TIC)參數(shù)，以免疫組化方法檢測MMP-2強(qiáng)度，探討靶向CEUS參數(shù)與MMP-2的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 BALB/cNude雌性裸鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g(北京維通利華生物科技有限公司)。人卵巢SKVO3癌細(xì)胞株SKVO3(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，超聲造影劑SonoVue(Bracco公司)，生物素化大鼠抗小鼠MMP-2單克隆抗體MMP-2[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記山羊抗大鼠IgG抗體(Ebioscience公司)，鏈霉親和素、生物素化脂質(zhì)(Sigma公司)，鼠抗人CD31單克隆抗體一抗，鼠抗人MMP-2單克隆抗體(Invitrogen公司)，山羊抗鼠生物素標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色液(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，PAS染色液(南京建成科技有限公司)。

1.2 建立模型 參考文獻(xiàn)[4]的方法建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型。將人卵巢SKOV3細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后以無血清1640培養(yǎng)液洗滌，并于37℃、5%CO2、完全飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整活細(xì)胞濃度為5×107個/ml，待卵巢癌SKOV3細(xì)胞株處于對數(shù)生長期且傳代培養(yǎng)至7～8代時提取細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，用含胎牛血清的高糖培養(yǎng)基漂浮洗滌，調(diào)整活細(xì)胞濃度至5×107個/ml，充分混勻，于裸鼠背部皮下接種細(xì)胞混懸液0.2 ml(含1×107個細(xì)胞)。根據(jù)接種后細(xì)胞移植時間分為5組，每組10只：Ⅰ組為移植后第7天，Ⅱ組為移植后第14天，Ⅲ組為移植后第21天，Ⅳ組為移植后第28天，Ⅴ組為移植后第35天。

1.3 制備靶向超聲造影劑 向SonoVue中注入磷酸鹽緩沖液3 ml，加入450 μg生物素化酯質(zhì)。經(jīng)恒溫輕搖、離心后，保留乳白色微泡聚集層；將鏈霉親和素加入生物素化的SonoVue中，收集上層微泡，再次加入生物素化的MMP-2鼠抗人單克隆抗體，靜置、洗滌，收集上層乳白色微泡。

1.4 CEUS檢查 采用百勝M(fèi)yLab 90超聲診斷儀，LA522探頭，頻率3～9 MHz。先行二維超聲檢查，選擇移植瘤最大切面后轉(zhuǎn)入對比脈沖序列(contrast pulse sequence, CPS)造影模式[5]，機(jī)械指數(shù)0.16，幀頻8 Hz。經(jīng)模型鼠尾靜脈注射SonoVue造影劑0.2 ml，行普通CEUS檢查，直至造影劑消退完全；1 h后注入相同劑量靶向造影劑，存儲從注入造影劑開始至造影劑完全消退的動態(tài)影像，用于脫機(jī)分析。采用Qontrast軟件獲得CEUS相關(guān)參數(shù)，包括峰值強(qiáng)度(peak intensity, PI)和達(dá)峰時間(time to peak, TTP)。

1.5 免疫組化 石蠟標(biāo)本組織經(jīng)微波抗原修復(fù)后，采用一抗為10%的羊血清封閉1∶100鼠抗人MMP-2單克隆抗體，于室溫下孵育2 h，以生物素標(biāo)識羊抗鼠抗體，室溫放置30 min，DAB反應(yīng)顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察。對所有動物均完成CEUS檢查后，以CD31/PAS免疫組化雙染法檢測VM，行MMP-2免疫組化檢測瘤體內(nèi)MMP-2抗原。VM為相鄰腫瘤細(xì)胞圍成的紫紅色的梭形或管狀結(jié)構(gòu)，MMP-2抗原陽性結(jié)果為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明確棕褐色沉著。由2名病理科主治醫(yī)師采用盲法閱片，隨機(jī)選取5個高倍鏡視野觀察，根據(jù)Formwitz半定量積分法計(jì)算MMP-2染色區(qū)域所占百分比：≤5%，0分；5%～25%，1分；<25%～50%，2分；<50%～75%，3分；>75%，4分。細(xì)胞著色程度：無色，0分；淺黃色，1分；黃色，2分；棕色，3分；MMP-2染色區(qū)域所占百分比與細(xì)胞著色程度的乘積評價MMP-2強(qiáng)度的表達(dá)結(jié)果：0分(-)；1～4分(+)；5～8分(++)；9～12分(+++)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布及方差齊性，以±s表示，采用配對t檢驗(yàn)比較普通與靶向CEUS的PI和TTP，采用Spearman相關(guān)分析靶向CEUS參數(shù)與MMP-2強(qiáng)度的相關(guān)性。∣r∣值≤0.3表示相關(guān)性較差，0.3<∣r∣≤0.6表示中度相關(guān)，0.6<∣r∣≤0.8表示有較高度相關(guān)性，∣r∣>0.8表示相關(guān)性很高。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 5組裸鼠普通和靶向CEUS的PI和TTP比較(±s)

表1 5組裸鼠普通和靶向CEUS的PI和TTP比較(±s)

組別PI(dB)TTP(s)Ⅰ組 普通CEUS49.21±12.3887.31±46.20 靶向CEUS71.08±13.7846.41±22.64 t值-3.732.51 P值0.0020.022Ⅱ組 普通CEUS39.71±12.8646.40±14.59 靶向CEUS63.03±17.5626.82±11.71 t值-3.383.30 P值0.0030.004Ⅲ組 普通CEUS58.50±12.8887.31±46.20 靶向CEUS71.36±7.9346.40±22.63 t值-2.682.51 P值0.0150.022Ⅳ組 普通CEUS41.91±13.9654.45±21.60 靶向CEUS58.30±13.1036.37±10.80 t值-2.712.36 P值0.0140.029Ⅴ組 普通CEUS57.86±9.7460.39±16.73 靶向CEUS72.96±8.0744.84±15.66 t值-3.772.14 P值0.0010.046

圖1 Ⅱ組裸鼠普通與靶向CEUS表現(xiàn) A、B.普通CEUS 15 s時瘤體呈低強(qiáng)化狀態(tài)(A)，TIC顯示TTP為53.14 s，PI為19.10 dB(B)； C、D.靶向CEUS 15 s時瘤體呈高強(qiáng)化狀態(tài)(C)，TIC顯示TTP為36.76 s，PI為32.40 dB(D)

2 結(jié)果

50只裸鼠移植瘤均建模成功。Ⅰ組裸鼠背部皮下可見小的點(diǎn)狀凸起，Ⅱ、Ⅲ組裸鼠背部實(shí)性小腫塊約5～10 mm，Ⅳ組實(shí)性腫塊最大徑均>10 mm；Ⅴ組部分裸鼠背部皮下的實(shí)性腫塊周圍略見少量出血點(diǎn)，解剖后可見糜爛及出血。

2.1 CEUS參數(shù)比較 二維超聲觀察，實(shí)質(zhì)性腫塊周邊及其內(nèi)可見少許星點(diǎn)狀血流信號；注射普通及靶向造影劑后，靶向CEUS充盈更迅速，且在瘤體內(nèi)停留時間更長，瘤體內(nèi)部及周邊的強(qiáng)化更明顯，造影劑逐漸充滿整個瘤體，7～8 min后造影劑逐漸消退至消失。同組裸鼠中，與普通CEUS參數(shù)比較，靶向CEUS的PI升高、TTP減低(P均<0.05)，見表1、圖1。

2.2 免疫組化結(jié)果 經(jīng)常規(guī)免疫組化SP法染色后，50個移植瘤標(biāo)本中均可發(fā)現(xiàn)不同程度黃染的MMP-2，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組中MMP-2呈大小不等的顆粒樣棕黃色，且多集中于VM，Ⅳ、Ⅴ組中MMP-2呈棕黃染的小團(tuán)塊狀，且多集中于新生血管及細(xì)胞外基質(zhì)中，見圖2。

2.3 相關(guān)性分析 Ⅰ組、Ⅳ組及Ⅴ組腫瘤組織靶向CEUS的PI、TTP與MMP-2均無明顯相關(guān)(PI：r=0.38、-0.47、0.17，P均>0.05；TTP：r=-0.74、0.07、-0.44，P均>0.05)；Ⅱ組及Ⅲ組腫瘤組織靶向CEUS的PI與MMP-2呈高度正相關(guān)(r=0.86、0.76，P<0.01、P=0.02)，TTP與MMP-2呈高度負(fù)相關(guān) (r=-0.84、-0.87，P=0.01、P<0.01)。

圖2 免疫組化染色病理圖(SP，×400) A.Ⅱ組，MMP-2呈棕色分布于VM(箭)； B.Ⅴ組，MMP-2呈大片棕色(箭)分布于細(xì)胞間質(zhì)和胞漿

3 討論

CEUS是通過向外周靜脈注入超聲造影劑，使大量微泡造影劑懸浮于血液，由此實(shí)現(xiàn)實(shí)時動態(tài)地觀察組織微血管灌注信息[6]。本研究采用“生物素—親和素”橋連接法，并以SonoVue為基礎(chǔ)制備靶向超聲造影劑，發(fā)現(xiàn)該造影劑可更特異性地顯示病灶微血管灌注全過程，提高CEUS檢查裸鼠移植瘤病灶的能力[7-8]。本研究中，與普通CEUS比較，靶向CEUS的PI更高、TTP更短。由于靶向造影劑靶點(diǎn)的抗原可與抗體一對一結(jié)合，使其停留在靶點(diǎn)的時間更長，故造影效果優(yōu)于普通造影劑；另外，惡性腫瘤血管多走行紆曲，且通透性好，故注入造影劑后微泡在血管內(nèi)流動加速，從而導(dǎo)致PI提前。

卵巢癌是婦科疾病中常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，嚴(yán)重威脅婦女生命及健康[9-10]。卵巢腫瘤的生長依賴于氧及其他營養(yǎng)物質(zhì)，需通過新生血管來增加血液供應(yīng)；且新生血管能表達(dá)大量特異性抗原，可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤組織生長。MMP-2主要通過分解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種影響因子來阻止癌細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)散，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[11-12]。趙小琪等[13]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌早期微循環(huán)系統(tǒng)VM中，圍繞VM管壁的腫瘤細(xì)胞分泌大量MMP-2，以溶解VM結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞外基質(zhì)成分，是卵巢癌早期VM產(chǎn)生及調(diào)控的關(guān)鍵因素，故MMP-2表達(dá)水平可作為判斷卵巢癌病情及預(yù)后的重要參考指標(biāo)。本研究以裸鼠卵巢癌移植瘤MMP-2為靶點(diǎn)，可使造影劑集聚于腫瘤組織內(nèi)，有利于靶向CEUS顯像；造影劑注入荷瘤鼠體內(nèi)后，靶向造影劑可與卵巢癌VM中特異性表達(dá)的MMP-2靶點(diǎn)相互結(jié)合，真實(shí)顯示腫瘤的灌注特點(diǎn)，故靶向CEUS技術(shù)可為早期、無創(chuàng)診斷卵巢癌提供可能[14]。

既往研究[15]表明，在接種3～6周后，移植瘤小鼠逐漸出現(xiàn)胸腹腔積液及惡病質(zhì)，從而導(dǎo)致荷瘤鼠死亡。由于荷瘤鼠卵巢癌成瘤時間較長，為準(zhǔn)確顯示靶向CEUS參數(shù)與卵巢癌MMP-2的相關(guān)性，本研究根據(jù)移植時間建立5組SKOV3移植瘤模型，通過免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)5組移植瘤標(biāo)本中均有MMP-2表達(dá)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組中MMP-2多集中于VM中表達(dá)，Ⅳ、Ⅴ組中MMP-2多集中于腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)中而較少集中于VM內(nèi)，提示VM在卵巢癌較早期產(chǎn)生特異性抗原，使卵巢癌致病力及侵襲力增高；而卵巢癌晚期由細(xì)胞外基質(zhì)的新生血管產(chǎn)生抗原為卵巢癌提供營養(yǎng)，加速腫瘤生長。上述發(fā)現(xiàn)為治療卵巢癌提供了新思路，即針對卵巢腫瘤不同生長時期可采用不同治療方法。

本研究Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ組中腫瘤組織靶向CEUS的PI、TTP均與MMP-2無明顯相關(guān)(PI：r=0.38、-0.47、0.17，P均>0.05；TTP：r=-0.74、0.07、-0.44，P均>0.05)，而Ⅱ組及Ⅲ組腫瘤組織靶向CEUS的PI均與MMP-2呈高度正相關(guān)(r=0.86、0.76，P<0.01、P=0.02)，TTP均與MMP-2呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.84、-0.87，P=0.01、P<0.01)，提示VM是卵巢癌早期血液灌注的重要影響因子，而卵巢癌晚期由腫瘤新生血管代替VM的供血循環(huán)，與上述病理結(jié)果一致。

本研究的主要局限性：僅按照移植時間進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ組裸鼠卵巢癌靶向CEUS與MMP-2存在高度相關(guān)，這些結(jié)果是否可代表早期裸鼠卵巢癌靶向CEUS與MMP-2相關(guān)尚需進(jìn)一步探討。