楊佳冰，周海寧，米榮升，張燁華，沙湧波，周永利，李志紅，李 莉，陳兆國*，王進(jìn)香*

(1.寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750011；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；3.寧夏平羅縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，寧夏平羅 753400)

牛隱孢子蟲病是由隱孢子蟲(Cryptosporidium)寄生于牛胃腸道或呼吸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)，引起牛的以嚴(yán)重腹瀉為主要特征的一種人獸共患的寄生性原蟲病[1]。牛感染隱孢子蟲主要表現(xiàn)為精神沉郁、厭食、腹瀉，糞便呈奶油狀，灰白色或黃褐色，有大量纖維素、血液和黏液，后呈透明水樣糞便，嚴(yán)重的引發(fā)死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

1971年，Panciera R等[3]報(bào)道全球首例牛感染隱孢子蟲(美國)，隨后世界范圍內(nèi)都有報(bào)道。關(guān)于我國牛隱孢子蟲的感染情況，周圣文等于1985年首次在黑龍江省奶牛中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染[4]，隨后我國多個(gè)省份都有報(bào)道，感染率在0.09%～82.00%[4-6]。對(duì)于寧夏牛隱孢子蟲的感染情況，已有學(xué)者對(duì)部分地區(qū)做了調(diào)查研究。檢測方法主要有漂浮和染色后的顯微鏡檢，以及PCR檢測，其感染率在1.68%～61.7%之間[7-10]。但是，這些報(bào)道只關(guān)注了寧夏部分地區(qū)的感染情況，而且多數(shù)是關(guān)于奶牛的調(diào)查研究[8]，目前尚不了解寧夏牛整體的感染情況，包括地域特征、年齡分布、品系差異等。本次調(diào)查選取了寧夏全部5個(gè)地級(jí)市，涵蓋10個(gè)縣(區(qū))的奶牛和肉牛規(guī)模養(yǎng)殖場，采集糞便樣品，采用牛隱孢子蟲糞便抗原檢測試劑盒，對(duì)全區(qū)的牛隱孢子蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查，為進(jìn)一步摸清全區(qū)牛隱孢子蟲的感染情況，制定全區(qū)牛隱孢子蟲的防控措施提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒 牛隱孢子蟲抗原檢測試劑盒(CryptosporidiumAg Test Kit)，貨號(hào)EBENT4-1001，美國Kernel公司產(chǎn)品。

1.1.2 糞便樣本的采集 2017年2月～4月，分別從寧夏10個(gè)縣(區(qū))的10個(gè)規(guī)模養(yǎng)殖場采集奶牛和肉牛糞便樣品600份，其中奶牛樣品240份，肉牛樣品360份。待檢樣品分別來自4個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(銀川市興慶區(qū)、中衛(wèi)市海原縣、石嘴山市惠農(nóng)區(qū)和平羅縣)和6個(gè)肉牛養(yǎng)殖場(銀川市賀蘭縣、吳忠市利通區(qū)和同心縣、固原市原州區(qū)和涇源縣、中衛(wèi)市沙坡頭區(qū))。所有養(yǎng)殖場按照斷奶前、育成牛、成年牛3個(gè)年齡段進(jìn)行采樣，每個(gè)年齡段采集樣品200份。樣品置于冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，1周內(nèi)處理完。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測 參照牛隱孢子蟲抗原檢測試劑盒說明書進(jìn)行。將0.5 g糞便樣品與4.5 mL洗滌工作液混合，充分混勻，離心后取上清液備用。每孔加入70 μL上清液，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照孔，分別加試劑盒提供的陰性和陽性溶液70 μL。樣品加好以后，將酶標(biāo)板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30 min。隨后用洗滌液洗板5次，每孔加入70 μL隱孢子蟲酶標(biāo)物，25℃孵育30 min。重復(fù)洗板5次，每孔加入100 μL底物，混勻，避光，25℃孵育10 min。觀察記錄結(jié)果。所有樣品重復(fù)3次。

1.2.2 判定標(biāo)準(zhǔn) 陰性對(duì)照應(yīng)該為無色或者淺藍(lán)色。陽性對(duì)照為深藍(lán)色。如果樣品藍(lán)色比陰性對(duì)照顏色深，該樣品為隱孢子蟲病原陽性，反之，樣品為陰性。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 利用Microsoft Excel 2013和SPSS 21.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)(χ2)方法，比較不同地區(qū)、不同日齡、不同品種牛的隱孢子蟲陽性率差異是否顯著。當(dāng)P<0.05時(shí)，判定為差異顯著；當(dāng)P<0.01時(shí)，判定為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)牛隱孢子蟲感染情況

本次調(diào)查涵蓋了全區(qū)5個(gè)地級(jí)市的10個(gè)縣(區(qū))的樣品，其中包括4個(gè)奶牛養(yǎng)殖場和6個(gè)肉牛養(yǎng)殖場，每個(gè)場采集樣品60份。結(jié)果顯示，牛隱孢子蟲總陽性率為26.17%(157/600)，其中奶牛陽性率為10.42%(25/240)，肉牛的陽性率為36.67%(132/300)，二者差異極顯著(P<0.01)(表1、表2和圖1)。4個(gè)地區(qū)奶牛陽性率分別為23.33%(石嘴山市惠農(nóng)區(qū))、15.00%(石嘴山市平羅縣)、1.67%(銀川市興慶區(qū))和1.67%(中衛(wèi)市海原縣)，4個(gè)場之間陽性率差異極顯著(P<0.01)(表1)。6個(gè)地區(qū)肉牛的陽性率分別為63.33%(固原市涇源縣)、55.00%(銀川市賀蘭縣)、48.33%(吳忠市同心縣)、20.00%(中衛(wèi)市沙坡頭區(qū))、18.33%(固原市原州區(qū))和16.67%(吳忠市利通區(qū))，不同地區(qū)之間陽性率差異極顯著(P<0.01)(表2)。

表1 不同地區(qū)奶牛場隱孢子蟲感染情況

注：同一列中相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05),different small letters mean significant difference (P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表2 不同地區(qū)肉牛場隱孢子蟲感染情況

注：同一列中相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05),different small letters mean significant difference (P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

2.2 不同年齡階段牛隱孢子感染情況

本次調(diào)查，每個(gè)牛場分3個(gè)年齡階段取樣，分別是斷奶前、育成牛和成年牛。結(jié)果顯示，奶牛樣品中育成牛和成年牛的陽性率均為11.25%(9/80)，高于斷奶前犢牛(8.75%，7/80)，不同年齡階段之間陽性率差異不顯著(P>0.05)(表3)；肉牛則隨著年齡的增長，隱孢子蟲陽性率逐漸增高，其中成年牛最高，為41.67%(50/120)，其次是育成牛35.00%(42/120)，斷奶前犢牛陽性率最低，為33.33%(40/120)，不同年齡階段之間陽性率差異不顯著(P>0.05)(表4)。統(tǒng)計(jì)分析表明，肉牛無論是在斷奶前(P<0.01)、育成階段(P<0.01)，還是成年階段(P<0.01)，隱孢子蟲的陽性率均極顯著高于奶牛(P<0.01)(圖2)。

圖1 奶牛和肉牛隱孢子蟲感染情況

年齡階段 Age stage樣品數(shù)Sample number陽性數(shù)Positive number陽性率/% Positive rate斷奶前 Pre-weaned8078.75a育成牛 Post-weaned80911.25a成年牛 Adult80911.25a合計(jì) Total2402510.42

注：同一列中相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05).

表4 不同年齡階段肉牛隱孢子蟲的感染情況

注：同一列中相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05).

圖2 不同年齡階段牛隱孢子蟲感染情況

3 討論

當(dāng)前，隱孢子蟲是僅次于輪狀病毒的第二大致腹瀉病原，對(duì)人群的危害十分嚴(yán)重，并且給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。寧夏畜牧業(yè)歷史悠久，是全國十大牧區(qū)之一。2015年末，全區(qū)牛飼養(yǎng)量達(dá)到250萬頭，其中肉牛存欄98.0萬頭，奶牛存欄40萬頭，牛出欄106萬頭，但是寧夏牛隱孢子蟲的感染情況的調(diào)查研究還非常少，而且多數(shù)是小范圍的調(diào)查。本研究選取了整個(gè)寧夏5個(gè)地級(jí)市的部分規(guī)模養(yǎng)殖場，應(yīng)用牛隱孢子蟲抗原ELISA檢測試劑盒，對(duì)10個(gè)縣(區(qū))的奶牛和肉牛養(yǎng)殖場進(jìn)行隨機(jī)取樣600份，檢出157份陽性樣品，總陽性率為26.17%。本次調(diào)查共檢測4個(gè)奶牛場，240份樣品，總的陽性率為10.42%，該結(jié)果低于之前用漂浮法和染色法對(duì)銀川和固原地區(qū)奶牛場進(jìn)行調(diào)查結(jié)果(50.9%，69/136；31.2%，148/475)[7-8]；高于利用PCR對(duì)寧夏奶牛的檢測結(jié)果(1.68%，23/1 366；5.45%，92/1 688)[9-10]。對(duì)于肉牛的檢測，本次調(diào)查選取了6個(gè)養(yǎng)殖場，采集樣品360份，總陽性率為36.67%，該結(jié)果高于楊建民等[8]對(duì)銀川和固原地區(qū)肉牛的檢測結(jié)果(16.8%，69/408)。上述結(jié)果的差異，可能與檢測方法的不同和采樣季節(jié)的不同有關(guān)。

統(tǒng)計(jì)分析表明，寧夏地區(qū)肉牛隱孢子蟲感染的陽性率顯著高于奶牛的陽性率，這與我國很多地區(qū)的調(diào)查結(jié)果都不相同。如對(duì)黑龍江和陜西的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，奶牛的陽性率要略高于肉牛的，但二者差異并不顯著[11-12]；對(duì)青海省西寧地區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肉牛的陽性率略高于奶牛，二者的差異并不顯著[13]；而對(duì)湖南和吉林延邊的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，奶牛的陽性率顯著高于肉牛[14-15]。造成這些結(jié)果的差異，可能與采用的檢測方法不同，采樣的地區(qū)不同有關(guān)。

對(duì)于不同年齡牛隱孢子蟲感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在肉牛中成年牛感染率最高，其次是育成牛，斷奶前犢牛陽性率最低；在奶牛中，成年牛與育成牛陽性率相同，均高于犢牛，而且各個(gè)年齡階段肉牛的陽性率均顯著高于奶牛。關(guān)于奶牛隱孢子蟲的調(diào)查，本次調(diào)查獲得的結(jié)果與鮑嘉銘等[7]對(duì)銀川地區(qū)奶牛的調(diào)查結(jié)果不同，該調(diào)查發(fā)現(xiàn)成年牛的陽性率(60.29%，41/68)要高于育成牛(44.1%，15/34)和犢牛(38.2%，13/34)；同樣，與Huang J等[9]和Zhang X X等[10]對(duì)寧夏部分地區(qū)奶牛樣品的分子檢測結(jié)果也不相同，分子檢測結(jié)果顯示，斷奶前犢牛隱孢子蟲陽性率最高，隨著年齡的增長，隱孢子蟲的陽性率逐漸下降。造成這些結(jié)果的偏差可能與檢測方法、采樣季節(jié)不同有關(guān)。

據(jù)報(bào)道，牛感染的蟲種主要有4種，分別為微小隱孢子蟲(C.parvum)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)和安氏隱孢子蟲(C.andersoni)，并且牛感染的隱孢子蟲蟲種與年齡相關(guān)，其中C.parvum主要感染斷奶前犢牛，C.bovis和C.ryanae主要感染斷奶后犢牛，C.andersoni主要感染成年牛[16]，其中C.parvum是感染人的主要蟲種。本試驗(yàn)采用的是隱孢子蟲糞抗原ELISA檢測方法，并不能夠鑒定牛感染的蟲種，因此，下一步需對(duì)陽性樣品進(jìn)行分子檢測，以評(píng)估其對(duì)人的潛在威脅。

目前國內(nèi)對(duì)隱孢子蟲的檢測，主要是顯微鏡鏡檢法和分子檢測，這兩種方法均耗時(shí)，需要有一定的工作基礎(chǔ)才可以操作。本研究采用的直接檢測糞抗原的ELISA方法，國內(nèi)尚屬首次，該方法不僅操作簡單、省時(shí)，而且非常適合田間樣品的初篩。有研究表明，糞便抗原ELISA檢測的敏感性要低于染色法和分子檢測方法，但是具有很好的特異性[17-19]。對(duì)寧夏地區(qū)的研究和以前的研究報(bào)道相比，該方法檢出的陽性率要低于顯微鏡鏡檢法，但是高于分子檢測方法，這可能與采樣的區(qū)域，采樣的季節(jié)相關(guān)，下一步有待對(duì)這批樣品分別進(jìn)行顯微鏡鏡檢和分子檢測，驗(yàn)證該方法的敏感性和特異性。

綜上所述，本研究在國內(nèi)首次應(yīng)用牛隱孢子蟲糞便抗原檢測試劑盒，對(duì)寧夏全區(qū)奶牛和肉牛進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果表明，本地區(qū)奶牛和肉牛均存在隱孢子蟲感染，且各個(gè)年齡段均易感。不同地區(qū)陽性率不同，肉牛的感染情況顯著高于奶牛。本次調(diào)查的結(jié)果對(duì)于制定和完善寧夏地區(qū)牛隱孢子蟲的防控方案，減少隱孢子蟲病對(duì)牛的危害，降低人畜感染的機(jī)率，提供有力的數(shù)據(jù)支撐。