林秀清　黃智銘　　陳新　　吳芳　　薛海波　　陳超

[摘要] 目的 檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞在胃癌患者外周血中的表達，探討兩種細(xì)胞在胃癌中的臨床意義。 方法 隨機選取我院收治的胃癌患者30例，作為胃癌組，另選取同期在我院進行健康體檢人員30例作為正常組，對兩組外周血中CD4、CD25、Foxp3、IL-17的表達進行檢測，分析CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的數(shù)量和比例。 結(jié)果 胃癌組外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的表達均高于正常組（P<0.05）；胃癌組中晚期、T3+T4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達分別高于早期、T1+T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05），但不同腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者之間Th17細(xì)胞的表達差異均不顯著（P>0.05）。 結(jié)論 胃癌患者外周血中CD4+CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的表達均顯著升高，且提示腫瘤進展和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)，但與Th17 細(xì)胞無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；外周血；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Th17細(xì)胞

[中圖分類號] R735.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）13-0021-04

The expression and clinical significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of patients with gastric carcinoma

LIN Xiuqing HUANG Zhiming CHEN Xin WU Fang XUE Haibo CHEN Chao

Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To assess the expression and discuss the clinical significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of patients with gastric carcinoma. Methods 30 patients with gastric carcinoma in our hospital were randomly selected as the gastric carcinoma group. 30 people who checked up their health condition in our hospital during the same period were selected as the normal group. The expression of CD4， CD25， Foxp3 and IL-17 in peripheral blood was assessed in both groups. The amount and proportion of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells were analyzed. Results The expression of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in gastric carcinoma group increased compared with that in normal group（P<0.05）. The expression of CD4+CD25+ regulatory T cells in peripheral blood of patients with advanced gastric carcinoma， gastric carcinoma in T3+T4 and gastric carcinoma with lymph node metastasis was higher than that in patients with early gastric carcinoma， gastric carcinoma in T1+T2 and gastric carcinoma without lymph node metastasis respectively（P<0.05）. No significant difference was noticed in the expression of Th17 cells in patients with gastric carcinoma in different stages， depth of infiltration or with lymph node metastasis（P>0.05）. Conclusion The expression of both CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of patients with gastric carcinoma increased significantly. It was also suggested the progression of gastric carcinoma was associated with CD4+CD25+ regulatory T cells， but not associated with Th17 cells statistically.

[Key words] Gastric carcinoma；Peripheral blood；CD4+CD25+ regulatory T cells；Th17 cells

胃癌是常見惡性腫瘤之一，我國是胃癌多發(fā)國家。但目前以手術(shù)為主的綜合治療方法療效不理想，且進展期胃癌大多失去手術(shù)機會，故近年來免疫治療越來越受到重視。很多相關(guān)研究均表明[1-3]，腫瘤宿主的免疫狀態(tài)對其發(fā)生發(fā)展會產(chǎn)生直接而深刻的影響。T細(xì)胞亞群及其功能特征研究一直是免疫學(xué)的研究熱點，CD4+輔助性T細(xì)胞可分為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th1、Th2、Th17細(xì)胞四種類型[4]。近年來，很多研究報道了Treg及Th17，證實Th17/Treg細(xì)胞失衡現(xiàn)象不僅存在于自身免疫性疾病中，還存在于移植物抗宿主病及炎癥性腸病中等疾病[5-7]，但是目前有關(guān)其在腫瘤發(fā)生中作用的相關(guān)報道不多。故本研究通過檢測胃癌患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的表達，探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2014年6月～2016年6月我院收治的胃癌患者30例作為胃癌組，納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)手術(shù)病理或胃鏡活檢證實為胃癌；排除標(biāo)準(zhǔn)：有心肝腎等重要臟器疾病、有腫瘤家族史等患者。其中男22例，女8例，年齡24～84歲，平均（62.3±10.4）歲。在腫瘤分期方面，6例為早期胃癌（ⅠA期、ⅠB期），24例為中晚期胃癌（ⅡA期、ⅡB期、ⅢA期、ⅢB期、Ⅳ期）。另選取同期在我院進行健康體檢的人員30例作為正常組，其中男20例，女10例，年齡25～84歲，平均（63.9±10.2）歲。兩組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞提取 清晨抽取兩組人員的3 mL空腹靜脈血，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，然后將外周血中PBMC分離出來，在此過程中將淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液）充分利用起來。

1.2.2 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測 配置1×106個/100 μL細(xì)胞懸液，標(biāo)記檢測新鮮分離的單個核細(xì)胞，將5 μL膜抗體異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）anti-human CD4、5 μl APC anti-human CD25加入試管中，設(shè)相應(yīng)的同型對照，在4℃的溫度下進行30 min的避光孵育，然后用PBS進行洗滌，將上清棄去后，將1 mL固定破膜劑加入其中，混勻，在常溫下進行45 min的避光孵育，然后將2 mL破膜緩沖劑加入其中，離心將上清棄去，將5 μl抗體PE anti-human Foxp 3加入其中，混勻，在4℃的溫度下進行45 min的避光孵育，然后將2 mL破膜緩沖劑加入其中，離心將上清棄去，將300 μL PBS加入到各管，充分混勻后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 Th17細(xì)胞檢測 配置1×106個/100 μL細(xì)胞懸液，標(biāo)記檢測新鮮分離的單個核細(xì)胞，將0.5 μL 1 μmg/mL PMA+0.5 μL 1 μg/mL Ionomycin加入其中，在37℃的培養(yǎng)箱中放置，進行1 h的刺激，將2 μL BFA加入其中，在37℃的培養(yǎng)箱中放置，進行3 h的刺激，然后對上清進行洗滌，將30 μL FITC anti-human CD4抗體加入試管中，設(shè)相應(yīng)的同型對照。在4℃的溫度下進行15 min的避光孵育，然后進行洗滌，將100 μL破膜劑加入其中，離心將上清棄去，將5 μL PE anti-human IL-17抗體加入其中，混勻，在4℃的溫度下進行30 min的避光孵育，進行洗滌，將上清棄去后再將300 μL PBS加入其中，充分混勻后用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 兩組患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的表達比較

胃癌組外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17細(xì)胞的表達均高于正常組（P<0.05）。見表2。

2.3 胃癌組患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的表達比較

胃癌組中晚期、T3+T4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達分別高于早期、T1+T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05），但不同腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者之間Th17 細(xì)胞的表達差異均不顯著（P>0.05）。見表3。

3討論

腫瘤對人類健康造成了嚴(yán)重威脅，在我國，惡性腫瘤患者達到了160萬人/年，在人類死亡病因中居首位[8]。因此，早期診斷和治療腫瘤成為臨床研究的重點，而現(xiàn)階段，在腫瘤的治療中，繼手術(shù)、放化療后，免疫治療在臨床得到了日益廣泛的應(yīng)用，其目的為將機體免疫系統(tǒng)激發(fā)調(diào)動起來，促進腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力的增強，對腫瘤細(xì)胞進行控制并將其殺傷[9]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因綜合作用的結(jié)果，除了環(huán)境、感染、遺傳因素外，機體免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)也是重要方面。T 細(xì)胞亞群及其功能特征研究一直是免疫學(xué)的研究熱點，Treg及Th17細(xì)胞是兩種淋巴細(xì)胞群，Treg 細(xì)胞主要功能是對機體免疫功能進行負(fù)向調(diào)節(jié)，Th17細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，但在不同腫瘤中作用不同，兩者關(guān)系復(fù)雜，現(xiàn)階段得到了臨床的廣泛重視[10]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[11-13]，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg在多種腫瘤中增加，如胃腸道腫瘤、肺癌等，以此認(rèn)為腫瘤患者可能有天然免疫反應(yīng)存在，而其分化及調(diào)節(jié)過程和Treg及Th17細(xì)胞具有極為密切的關(guān)系。相關(guān)動物實驗表明[14-16]，隨著腫瘤不斷進展，Treg及Th17細(xì)胞比例逐漸提升，同時在進展期腫瘤中的表達水平最高。

既往研究表明[17-18]，Th細(xì)胞亞群間具有可塑性，在腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor β，TGF-β）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）的作用下，F(xiàn)oxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠重新編程向Th17樣細(xì)胞分化，對初始CD4+T細(xì)胞進行誘導(dǎo)，向Treg細(xì)胞分化，F(xiàn)oxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也能夠向Th17細(xì)胞分化，提示兩種細(xì)胞亞群間關(guān)系密切?，F(xiàn)階段，相關(guān)研究證實[19-20]，Th17表達水平在多種惡性腫瘤患者體內(nèi)均較高，如前列腺癌、卵巢癌、胃癌等。本研究結(jié)果提示，胃癌組外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17細(xì)胞的表達均顯著高于正常組（P<0.05）；胃癌組中晚期、T3+T4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達分別顯著高于早期、T1+T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05），與上述研究結(jié)果一致，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和腫瘤進展相關(guān)，可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。雖然結(jié)果未提示Th17細(xì)胞與腫瘤進展存在顯著統(tǒng)計學(xué)相關(guān)，但Th17細(xì)胞本身功能和機制復(fù)雜，有待進一步深入研究。

綜上所述，胃癌患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 Th17細(xì)胞的表達均顯著升高，且提示腫瘤進展和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)，但和Th17細(xì)胞無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)，有助于我們?nèi)娴亓私饣颊叩拿庖呦到y(tǒng)情況，對于臨床的療效和預(yù)后判斷具有重要的意義。但是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞在胃癌中的具體作用機制有待進一步深入的研究。

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（收稿日期：2017-12-01）