李華杰 徐雄峰 邱波

[摘要] 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來源廣泛并具有多向分化潛能，被視為組織修復(fù)重建領(lǐng)域的新希望。但近年的研究表明，傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)模式改變了細(xì)胞生長的原始環(huán)境，會(huì)導(dǎo)致MSCs自主分化、干性衰退等諸多問題，移植體內(nèi)后治療效果不佳。研究證據(jù)表明，相較于傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)，3D-球體培養(yǎng)方式對(duì)MSCs的生物活性具有顯著促進(jìn)作用。殼聚糖薄膜（CM）培養(yǎng)是一種新型生物膜誘導(dǎo)MSCs成球方法，本文主要從MSCs形態(tài)學(xué)、生物功能的變化及其潛在機(jī)制方面對(duì)MSCs的CM成球培養(yǎng)模式進(jìn)行綜述，并探討其在MSCs臨床應(yīng)用方面的潛力。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細(xì)胞；3D-球體；殼聚糖薄膜；干性

[中圖分類號(hào)] R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）05（b）-0021-05

Research progress and clinical application prospect in 3D-sphere culture of mesenchymal stem cell with chitosan membrane

LI Huajie XU Xiongfeng QIU Bo

Department of Orthopedics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Mesenchymal stem cells （MSCs） with a wide range of sources and multipotential differentiation are thought as a new hope in the field of tissue repair and reconstruction. However， recent research shows that traditional adherent culture changes the initial growing environment of MSCs， leading to self-differentiation， stemness recession and other problems， which brings a negative effect to the treatment after in vivo transplantation. And the evidence suggests that， compared with the traditional adherent culture， the 3D-sphere culture plays a significant role in promoting the biological activity of MSCs. Chitosan membrane （CM） culture is a new type of biomaterial substrate-mediated multicellular spheroid cultivation for MSCs. This review discusses the CM culture of MSCs mainly from the change of morphology， biological functions and potential mechanisms， as well as its potential in clinical application.

[Key words] Mesenchymal stem cells； 3D-sphere； Chitosan membrane； Stemness

近年來，干細(xì)胞尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）越來越受到醫(yī)學(xué)研究者的重視，因其具有多向分化潛能被視為組織修復(fù)領(lǐng)域的新希望。原代MSCs可以從脂肪、臍帶、軟骨、牙齦等多種組織中獲取[1-2]，特定條件下可分化為脂肪、骨、軟骨等多種類型細(xì)胞，在減少腎損傷、肝組織再生、增強(qiáng)傷口愈合等方面均被證實(shí)發(fā)揮治療作用[3]。然而，近年學(xué)者們發(fā)現(xiàn)貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs生物活性較低[4]，究其原因，MSCs體外平鋪式的生長狀態(tài)與其生物體內(nèi)的團(tuán)塊聚集模式有很大差異，微環(huán)境的改變使MSCs喪失了部分干細(xì)胞特性[5]。例如，體外培養(yǎng)通常不能夠維持MSCs的性狀穩(wěn)定，自主分化、干性衰退，歸巢能力減弱等問題亟待解決[6-7]。殼聚糖薄膜（chitosan membrane，CM）培養(yǎng)是一種新型的生物膜細(xì)胞培養(yǎng)法，此種方式可誘導(dǎo)MSCs自發(fā)形成細(xì)胞球體，對(duì)其干細(xì)胞特性、移植活力、旁分泌效應(yīng)、遷徙趨化等生物功能均有促進(jìn)作用[8]。本文將對(duì)CM培養(yǎng)誘導(dǎo)的MSCs球體在形態(tài)學(xué)、生物功能上的變化及其潛在機(jī)制進(jìn)行綜述，并分析其臨床應(yīng)用前景。

1 制備CM作培養(yǎng)基底物

殼聚糖是廣泛存在于大自然界中的甲殼素衍生物，是一種帶正電荷的天然多糖，作為組織工程支架材料被廣泛研究[9-10]。制備CM通常取殼聚糖粉末在1%乙酸水溶液中溶解并在室溫下攪拌12 h以獲得1%殼聚糖溶液，以1.5mL/孔均勻涂布于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于層流柜蒸發(fā)24 h。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前，形成的CM紫外線暴露過夜，然后用0.5 mol/L NaOH溶液中和處理30 min，用蒸餾水充分洗滌，最后用磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗滌[11]。

2 CM底物培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及其潛在機(jī)制

常規(guī)聚苯乙烯平板表面接種后，MSCs表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞形態(tài)的貼壁細(xì)胞，增殖后聚集成簇，而在CM作為底物的的培養(yǎng)條件下單個(gè)細(xì)胞的體積明顯較小，短暫貼壁后聚集為球狀體，并進(jìn)行性增大[12]。在其他物理方式誘導(dǎo)的MSCs成球培養(yǎng)體系中黏附力較低，細(xì)胞之間先通過細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和整合蛋白的相互接觸從而形成松散的多細(xì)胞團(tuán)塊，之后細(xì)胞間的接觸愈加頻繁，細(xì)胞團(tuán)塊逐漸聚攏，最終變成致密的細(xì)胞球[13]。而采用黏附力較強(qiáng)的CM作為底物的培養(yǎng)體系中，MSCs成球原理則完全不同，CM上的MSCs運(yùn)動(dòng)活躍，細(xì)胞先在基底膜黏附并伸展，然后收起偽足聚集成團(tuán)，細(xì)胞球體間也會(huì)發(fā)生再融合[12]。

研究表明CM底物誘導(dǎo)MSCs成球的一系列過程與CM釋放的鈣密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中觀察到CM上的MSCs球狀體細(xì)胞內(nèi)的鈣水平顯著升高，證實(shí)了殼聚糖結(jié)合的鈣進(jìn)入細(xì)胞，而減小CM的厚度以及加入EGTA（一種Ca2+螯合劑），發(fā)現(xiàn)MSCs球體的直徑減小，這可能是改變了鈣儲(chǔ)庫容量的結(jié)果[14]。因此，CM可能通過其表面結(jié)合的鈣轉(zhuǎn)移到MSCs中，影響細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞間的相互作用，從而對(duì)成球發(fā)揮作用。鈣黏蛋白在細(xì)胞間力傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，研究證實(shí)CM上MSCs球體的N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，其可能通過整合素相關(guān)通路調(diào)節(jié)以促進(jìn)MSCs球體的產(chǎn)生；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)CM誘導(dǎo)的MSCs球體中各種鈣相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，證實(shí)了鈣信號(hào)在CM形成的MSCs球體中的關(guān)鍵作用，這在其他球體培養(yǎng)系統(tǒng)中尚未見報(bào)道[11]。此研究還在殼聚糖膜上發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞黏附遷移有關(guān)的基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）。MMP是降解ECM的蛋白水解酶，在細(xì)胞遷移以及ECM蛋白和黏附分子的加工中起重要作用[15]。這些與CM上觀察到的MSCs高遷移率一致，而CM上的MSCs的活躍運(yùn)動(dòng)可能促進(jìn)了MSCs球體的形成。盡管觀察到基因、蛋白質(zhì)表達(dá)的一些變化，但是在CM誘導(dǎo)MSCs球體形成的確切機(jī)制還尚未闡明，而MSCs在CM上形成球體后的“3D效應(yīng)”也是其生物學(xué)功能發(fā)生變化的重要基礎(chǔ)[12]。

3 CM培養(yǎng)MSCs的生物學(xué)功能改變

3.1 CM誘導(dǎo)的MSCs球體的干性基因表達(dá)

研究證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog對(duì)維持多能胚胎干細(xì)胞分化潛能至關(guān)重要[16]，這些干性標(biāo)志物基因同樣存在于成體干細(xì)胞中[17]。通過基因分析證實(shí)了CM上MSCs球體的Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)水平較常規(guī)培養(yǎng)顯著上調(diào)，且在經(jīng)過轉(zhuǎn)化生長因子-β3（transforming growth factor-βtype 3，TGF-β3）誘導(dǎo)后，殼聚糖膜上MSCs球狀體表現(xiàn)了更好的中軟骨細(xì)胞分化能力，有更高的糖胺聚糖及Ⅱ型膠原表達(dá)水平[18]；CM培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞球體通過5-氮雜-2-脫氧胞苷誘導(dǎo)后，心臟標(biāo)志物基因（Gata4、Nkx2.5、Tnnt2和Myh6）的表達(dá)水平較平板培養(yǎng)也顯著提高[14]。這些證實(shí)了CM成球培養(yǎng)對(duì)MSCs的干性維持及多向分化具有促進(jìn)作用。

很多研究者認(rèn)為干性基因的維持與球體形成現(xiàn)象高度相關(guān)，這在其他MSCs球體培養(yǎng)體系中也被證實(shí)[13]，與非黏附性材料聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）表面形成的球體對(duì)比發(fā)現(xiàn)CM誘導(dǎo)形成的MSCs球體更大，且有更高的干性基因表達(dá)水平[11]。這表明除了誘導(dǎo)MSCs形成細(xì)胞球體本身之外，MSCs與CM底物之間的相互作用對(duì)MSCs的干性維持也可能發(fā)揮了作用。

3.2 CM誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞球體的活力與移植活性

研究者通過臺(tái)盼蘭染料排斥實(shí)驗(yàn)來評(píng)估單層和球體細(xì)胞中存活的MSCs的百分比，發(fā)現(xiàn)CM培養(yǎng)的MSCs球體與平板培養(yǎng)的MSCs，細(xì)胞活力均超過95%；為了評(píng)估球體細(xì)胞的增殖潛力，將MSCs球體用胰蛋白酶解離并接種回聚乙烯平板培養(yǎng)，與單層MSCs相比，球體衍生的MSCs在開始時(shí)表現(xiàn)出較慢的增長，但是在稍晚的時(shí)間點(diǎn)即開始出現(xiàn)較為活躍的增殖過程。在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將數(shù)量相同的CM底物誘導(dǎo)MSCs球體解離細(xì)胞和平板培養(yǎng)的細(xì)胞分別注射入裸鼠后肢中，CM組中檢測(cè)到了更高水平的抗人核抗原（human nuclear antigen，HNA）水平，MSCs薄膜誘導(dǎo)的球體MSCs表現(xiàn)出了更好的滯留作用及增殖潛力[19]。因此，若在移植前通過CM培養(yǎng)法移植治療前誘導(dǎo)MSCs形成球體，可能會(huì)顯著提升治療效果。

3.3 CM誘導(dǎo)的MSCs球體的黏附遷移趨化能力

研究發(fā)現(xiàn)CM的MSCs的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP家族基因表達(dá)上調(diào)，這與MSCs在CM上的高遷移率現(xiàn)象一致。此外還觀察到在殼聚糖上MSCs球體中控制細(xì)胞間黏附的多種基因上被上調(diào)，包括鈣黏蛋白、細(xì)胞黏附分子、Notch和肝配蛋白受體等，此類細(xì)胞黏附基因表達(dá)的增強(qiáng)可以使細(xì)胞在球體形成中更好地進(jìn)行通訊及協(xié)調(diào)。相對(duì)平板培養(yǎng)，CM上MSCs球體細(xì)胞的趨化因子及其受體的上調(diào)尤其具有重要意義[11]，結(jié)果顯示編碼趨化因子樣受體1（chemokine like receptor 1，CMKLR1）的基因高表達(dá)（約50倍）。它同時(shí)也是chemerin受體23（Chemerin Receptor 23，ChemR23），而Chemerin/CMKLR1相互作用也被報(bào)道可促進(jìn)脂肪形成和血管生成[20]；其他上調(diào)的趨化因子受體或配體包括趨化因子受體4和7（chemokine receptor type 4 andtype 7，CXCR4和CXCR7），它們是基質(zhì)衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF1）的受體，而CXCR4是研究最多的趨化因子受體之一，在細(xì)胞遷移，增殖和分化中發(fā)揮重要作用[21]。而表達(dá)上調(diào)的單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和MCP-3對(duì)MSCs來說則是重要的歸巢因素[11]。由于遷移趨化功能對(duì)MSCs的治療性能至關(guān)重要，CM誘導(dǎo)的MSCs球狀體的遷移和趨化性值得進(jìn)一步深入研究。

3.4 CM培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞球體的抗炎抗腫瘤作用

有研究表明，與平板培養(yǎng)相比，球體培養(yǎng)模式中對(duì)MSCs旁分泌具有增強(qiáng)作用，比如骨髓來源MSCs球體分泌的抗炎因子TNF-α刺激基因6（TNF-α stimulated gene 6，TSG-6）可在小鼠心肌梗死中有效減輕炎性反應(yīng)[22]；白細(xì)胞介素24（Interleukin 24，IL-24）的分泌的增加能降低腫瘤細(xì)胞的活性[23]，而CM誘導(dǎo)的球體MSCs也被證實(shí)具有類似的生物學(xué)性能改變[11]。CM培養(yǎng)MSCs細(xì)胞球體中許多抗炎基因的表達(dá)水平上調(diào)，包括白細(xì)胞介素1受體拮抗劑（interleu-kin-1 receptor antagonist，IL1RN）、白細(xì)胞介素4誘導(dǎo)的蛋白1（Interleukin 4 induced protein 1，IL4I1）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等。腫瘤壞死因子超家族成員9（recombinant tumor necrosis factor receptor superfamily，member 9，TNFSF9）也被上調(diào)，其可通過CD137受體/配體系統(tǒng)介導(dǎo)免疫抑制和免疫刺激[24]。而上調(diào)的LIF、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）被認(rèn)為是與MSCs的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)有關(guān)的因子[25]。這類基因在移植物抗宿主病和自身免疫性疾病的臨床治療中發(fā)揮重要作用。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)CM上MSCs有少量抗腫瘤基因上調(diào)。尤其是CM上MSCs觀察到高表達(dá)的IL-24基因。IL-24被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因，可以選擇性地誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而不影響正常細(xì)胞[26-27]。腫瘤蛋白p53（tumor protein 53，tp53）是另一種上調(diào)的腫瘤抑制基因，涉及多種關(guān)鍵的細(xì)胞功能，如增殖、細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)機(jī)制[28]。這些結(jié)果表明CM培養(yǎng)促進(jìn)了MSCs的分泌功能，在減輕炎癥及抗腫瘤方面具有廣闊的應(yīng)用潛力。

4 CM誘導(dǎo)的MSCs球體生物學(xué)功能改變的潛在機(jī)制

4.1球體效應(yīng)

類似其他三維細(xì)胞培養(yǎng)體系，CM形成的MSCs球體是個(gè)復(fù)雜的多細(xì)胞聚合體，這種“球體效應(yīng)”無疑是MSCs生物活性變化的重要基礎(chǔ)。

首先，MSCs球體營造的輕度缺氧環(huán)境可能比正常培養(yǎng)條件下（21%O2）更接近MSCs的自然生長狀態(tài)（例如骨髓中的O2張力為1%～7%），MSCs可以從缺氧中受益，從而抑制衰老，增加增殖，并增強(qiáng)其間充質(zhì)譜系的分化潛能[29-30]。其次，球體結(jié)構(gòu)為MSCs細(xì)胞間接觸提供了更好的三維空間，通過緊密的聯(lián)系，促進(jìn)細(xì)胞間物質(zhì)信息交換能力。比如觀察到CM上MSCs球體的EphA7上調(diào)，其在軸突受體傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，而此類細(xì)胞黏附基因的增強(qiáng)可在MSCs球體中提供更好的細(xì)胞通訊和協(xié)調(diào)功能，從而使MSCs球體更好的發(fā)揮生物學(xué)活性[11]。同時(shí)，CM上球體的形成，更大程度發(fā)揮了ECM對(duì)MSCs的支持作用。研究發(fā)現(xiàn)球體MSCs的ECM合成效率較貼壁培養(yǎng)模式顯著增強(qiáng)，ECM可通過細(xì)胞膜表面的整合蛋白將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，從而系統(tǒng)地調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)[31]。而關(guān)于CM上MSCs的球體效應(yīng)對(duì)MSCs 的影響仍然需要進(jìn)一步的深入研究。

4.2 細(xì)胞底物相互作用

通過分析CM底物衍生的3D MSCs球體對(duì)2D培養(yǎng)的MSCs的基因表達(dá)譜，證實(shí)了諸多底物依賴性基因的參與誘導(dǎo)MSCs球體的產(chǎn)生并促進(jìn)其生物活性，而這種細(xì)胞底物作用機(jī)制也是CM培養(yǎng)方式與其它3D培養(yǎng)體系的本質(zhì)區(qū)別。鈣相關(guān)基因的特異性調(diào)節(jié)可能參與了CM上MSCs球體的產(chǎn)生，同時(shí)黏附遷移及抗炎抗腫瘤相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，這在上文中已經(jīng)提到。通過CM與PVA分別誘導(dǎo)形成球體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CM上MSCs的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)較PVA更加明顯，CM的持續(xù)調(diào)節(jié)效應(yīng)與PVA的瞬時(shí)上調(diào)表明了細(xì)胞-底物相互作用在MSCs基因調(diào)控中的重要性[11]。

4.3 自噬作用

自噬現(xiàn)象普遍存在于大部分真核細(xì)胞中，主要介導(dǎo)了損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的特異性降解，而自噬激活通常被認(rèn)為是細(xì)胞存活的適應(yīng)性和保護(hù)機(jī)制[32]。關(guān)于CM上培養(yǎng)對(duì)MSCs自噬方面的研究較少。

在既往研究中，提出CM誘導(dǎo)形成的MSCs球狀體中自噬增強(qiáng)的觀點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中觀察到CM培養(yǎng)方法增強(qiáng)了MSCs的自噬反應(yīng)，且自噬水平與球體形成的效率相關(guān)聯(lián)，Ca2+可能在CM底物衍生的MSCs球體的自噬誘導(dǎo)中發(fā)揮了積極作用。而MSCs球狀體中的增強(qiáng)的自噬不僅可以保護(hù)細(xì)胞形成應(yīng)激，還可以防止細(xì)胞在體外擴(kuò)增期間的早期衰老，從而使MSCs移植后具有更好的生存和治療效果[33]。而近期的一項(xiàng)研究提出了新的觀點(diǎn)，認(rèn)為CM底物上MSCs球體中心的原始MSCs發(fā)生自噬活化，而附著于球體外周的晚期衰老細(xì)胞，發(fā)生自噬失活，進(jìn)而被誘導(dǎo)凋亡，因此推測(cè)CM成球培養(yǎng)方式通過抑制自噬特異性誘導(dǎo)晚期衰老細(xì)胞凋亡以增強(qiáng)MSCs的干細(xì)胞特性[34]。

5 CM培養(yǎng)MSCs的臨床應(yīng)用前景

5.1 組織修復(fù)領(lǐng)域的治療潛力

與傳統(tǒng)的MSCs注射療法相比，通過各種方式誘導(dǎo)形成的MSCs球體展現(xiàn)出了更好的治療效果，而通過CM誘導(dǎo)形成的MSCs 球體具有以下治療優(yōu)勢(shì)：CM誘導(dǎo)形成的MSCs球體具有更強(qiáng)的多向分化潛能和遷移趨化能力，移植后可更高效的定向分化，修復(fù)受損組織；“球體效應(yīng)”營造的低氧等環(huán)境使MSCs的適應(yīng)能力加強(qiáng)，并加強(qiáng)了抗炎抗腫瘤等活性因子的釋放；CM培養(yǎng)方法較其他成球培養(yǎng)方式技術(shù)要求簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模推廣。基于以上優(yōu)勢(shì)，若在移植前通過CM培養(yǎng)對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理，可有效增強(qiáng)MSCs的生物活性，更好地發(fā)揮其修復(fù)組織的效果。

5.2 分選原始MSCs的應(yīng)用潛力

MSCs是異質(zhì)性細(xì)胞群體，連續(xù)的傳代培養(yǎng)可能造成其不同程度的衰老，而維持干細(xì)胞特性對(duì)MSCs的治療作用至關(guān)重要。CM上MSCs細(xì)胞球體干性基因表達(dá)水平的上調(diào)可能歸因于從異質(zhì)群體中分選出了更為原始的MSCs。

此前有研究發(fā)現(xiàn)，異質(zhì)性牙齦纖維細(xì)胞在CM培養(yǎng)后形成的細(xì)胞球體較其他細(xì)胞具有更高的干性基因的表達(dá)水平，實(shí)質(zhì)上從異質(zhì)的細(xì)胞集團(tuán)中篩選到更具干性的更具多向分化潛能的MSCs亞群，推測(cè)其與鈣黏蛋白的高表達(dá)有關(guān)[35]。近期的研究結(jié)果認(rèn)為，CM培養(yǎng)MSCs特異性地激活衰老細(xì)胞中mTORC1途徑以滅活自噬，誘導(dǎo)其凋亡，從而選擇更具分化潛能的MSCs。CM培養(yǎng)過程中，MSCs起初3 d發(fā)生了顯著的細(xì)胞凋亡，MSCs球體中外圍細(xì)胞出現(xiàn)死亡，并且與早期傳代相比，晚期傳代的細(xì)胞球體外圍出現(xiàn)更高的凋亡細(xì)胞比例，表明其誘導(dǎo)凋亡對(duì)衰老細(xì)胞具有特異性[35]。這可能解釋了CM培養(yǎng)MSCs球體具有更高的干性基因表達(dá)水平的原因，一定程度展現(xiàn)出CM培養(yǎng)在分選高效MSCs用于再生醫(yī)學(xué)的可行性。

6 小結(jié)

綜上所述，CM培養(yǎng)方式誘導(dǎo)形成的MSCs球體較傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的MSCs在干性維持、旁分泌效應(yīng)及遷移趨化等生物活性方面均有顯著提升，這為臨床上提高M(jìn)SCs細(xì)胞療法的效果提供了新思路。目前，關(guān)于CM成球培養(yǎng)增強(qiáng)MSCs生物活性的機(jī)制以及相關(guān)信號(hào)通路有一定了解，但還有大量問題需要進(jìn)一步深入研究。比如，CM培養(yǎng)模式下誘導(dǎo)MSCs 聚集成球及生活學(xué)功能改變的具體機(jī)制；探討CM成球培養(yǎng)分選原始MSCs的可行性；CM培養(yǎng)方式下如何獲得大量均勻、適當(dāng)粒徑的MSCs球體，既達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞生物活性而不至于導(dǎo)致中央?yún)^(qū)細(xì)胞缺氧壞死。揭開這些問題有助于進(jìn)一步了解CM誘導(dǎo)MSCs球體的理化性質(zhì)，建立更加穩(wěn)定的CM成球培養(yǎng)體系，從而推動(dòng)MSCs的臨床應(yīng)用。