靶向PDCD5-Caspase-3融合基因過表達對HepG2肝癌細胞增殖與凋亡的影響

胥丹，姜淮蕪，蒲羽

（1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.四川綿陽404醫(yī)院腹部外科，四川 綿陽 621000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前臨床常見惡性腫瘤之一，世界上癌癥相關死亡的第二大腫瘤類型，世界每年肝癌新發(fā)病例52.3萬例[1]。目前治療手段有限，主要以放療、化療和分子靶向藥物治療為主，5年存活率＜5%，預后不佳[2-3]。HCC發(fā)生與發(fā)展與腫瘤細胞凋亡關系密切，而誘導細胞凋亡的策略成為近年來晚期HCC治療重點。PDCD5和Caspase-3蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡關鍵酶，調控細胞凋亡信號傳導的中心環(huán)節(jié)，能促進細胞凋亡發(fā)生[4-5]。本研究通過慢病毒轉染靶向PDCD5-Caspase-3融合基因過表達作用于人肝癌細胞HepG2，觀察PDCD5和Caspase-3蛋白對HepG2肝癌細胞增殖和凋亡作用的影響，初步探討其作為肝癌治療潛在靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

人HepG-2肝癌細胞（購自上海復祥生物科技有限公司），胰蛋白酶、DMEM無血清培養(yǎng)基和胎牛血清（購自美國Gibco公司），青霉素和鏈霉素（購自上海生物工程有限公司），CCK-8檢測試劑盒、APCAnnexin V細胞凋亡試劑盒和蛋白提取試劑盒（購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），鼠抗人單克隆PDCD5抗體、鼠抗人單克隆Caspase-3抗體（購自美國Acom公司），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗鼠IgG（購自美國Sigma公司），兔抗鼠β-actin單克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司）。蛋白電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。PDCD5-Caspase-3融合基因合成及轉染用慢病毒均由上海吉凱基因公司提供。

1.2 PDCD5-Caspase-3融合基因構建及慢病毒包裝

利用PubMed基因數(shù)據(jù)庫查詢PDCD5和Caspase-3基因CDS序列，設計相應融合基因序列，PCR擴增PDCD5-Caspase-3融合基因片段，將目的融合基因克隆到慢病毒GV358中，引物序列：正向5'-CCATCAGAGAGAAAACCGAAC-3'，反向 5'-CCTCT TATAGTCCACTTATGTC-3'，PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次，72℃延伸5 min，最后取適量菌液進行測序，測序結果與目的基因序列進行比對分析，測序結果與與目標序列完全一致。抽提Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP質粒，采用二代自失活型慢病毒包裝系統(tǒng)完成包裝過程，將攜帶PDCD5-Caspase-3融合基因的GV358載體質粒、包裝質粒pHelper 1.0和pHelper 2.0共轉染239T細胞，轉染48 h后，高速離心收集含慢病毒顆粒的239T細胞上清液，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HepG-2肝癌細胞轉染

HepG-2肝癌細胞株活性強，增殖旺盛，2～3 d即可傳代1次，待培養(yǎng)細胞貼壁生長至培養(yǎng)瓶的80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化，離心收集，含10%DMEM培養(yǎng)基重懸，按照3×105個/ml種植24孔板中，每孔400 μl。按照吉凱公司推薦的HepG-2肝癌細胞最佳轉染復數(shù)為100，設置3組：①實驗組（5 μg/ml Polybrene+50 μl Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP病毒上清液）；②對照組（5 μg/ml Polybrene+50 μl陰性對照病毒上清液）；③空白組（不加病毒上清液）；37℃培養(yǎng)箱中孵育12 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。由于質粒中含有EGFP基因，本研究利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測實驗組轉染效率。

1.4 Western blot檢測PDCD5和Caspase-3蛋白表達

轉染細胞48 h后，離心收集5×105個各組細胞，PBS清洗3次，蛋白裂解液提取細胞蛋白，BCA法測定樣品中總蛋白濃度，蛋白變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉膜80V 2 h，5%脫脂奶粉封閉lh，剪膜，加入1∶300稀釋鼠抗人單克隆PDCD5抗體（一抗）和1∶500鼠抗人單克隆Caspase-3抗體（一抗），4℃孵育過夜，加入1∶400 HRP標記二抗室溫孵育30 min，1∶1 000稀釋β-Actin作為內參，在ECL顯色系統(tǒng)中顯色定影，AlphaEase FC軟件分析顯色的雜交條帶。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖

HepG-2肝癌細胞轉染后，以1×105個/ml種植96孔板，每孔100 μl，每組9孔，在轉染24、48和72 h，各組均分別選取3孔檢測細胞增殖情況，每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃，5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀檢測各孔吸光度（A）值，波長450 nm，參比波長為630 nm。每孔復測3次，取結果平均值行統(tǒng)計分析。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

按照APC-Annexin V細胞凋亡試劑盒說明書操作，細胞轉染72 h后，PBS清洗2遍，胰酶消化，離心收集細胞，每管收集2×105個細胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5 μl Annexin VAPC和5 μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應30 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較，方差齊性用LSD-t檢驗，方差不齊用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結果

2.1 細胞轉染效率

轉染12 h后，PBS清洗細胞2遍，流式細胞儀上樣檢測細胞轉染率達到98.7%（見圖1A），熒光顯微鏡下觀察到滿視野綠色熒光分布（見圖1B），表明Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP慢病毒能高效轉染HepG-2肝癌細胞，能用于后續(xù)實驗。

2.2 PDCD5和Caspase-3蛋白表達情況

轉染72 h后，實驗組、對照組和空白組PDCD5蛋白相對表達量分別為（0.427±0.094）、（0.171±0.059）和（0.202±0.077），各組PDCD5蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.100，P=0.036），實驗組PDCD5蛋白水平較對照組或空白組均增加，對照組與空白組無差異。實驗組、對照組和空白組Caspase-3蛋白相對表達量分別為（0.625±0.132）、（0.151±0.089）和（0.139±0.067），各組Caspase-3蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.969，P=0.017），實驗組Caspase-3蛋白水平較對照組或空白組均增加，對照組與空白組無差異（P＞0.05）。見圖2。

圖1 細胞轉染效率

圖2 各組PDCD5和Caspase-3蛋白表達

2.3 細胞增殖變化

細胞轉染72 h后，實驗組細胞增殖能力較對照組和空白組降低，實驗組、對照組和空白組OD值分別 為（1.19±0.23）、（2.18±0.51） 和（2.33±0.48），各組OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.509，P=0.044），實驗組OD值較對照組或空白組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對照組與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 細胞凋亡情況

轉染72 h后，空白組細胞凋亡率為（2.33±1.02）%，對照組的細胞凋亡率為（2.94±0.81）%，實驗組細胞凋亡率為（37.7±5.65）%，各組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=49.728，P=0.0184），實驗組細胞凋亡率較對照組或空白組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對照組與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖 3。

圖3 細胞凋亡率比較

3 討論

近10年，全世界范圍內HCC發(fā)病率上升。若HCC早期診斷（腫瘤直徑＜2 cm），予以手術切除，則生存率可達到70%[6]。然而，臨床HCC患者就診時已屬癌癥晚期，治療效果較差，無法單靠手術切除治愈。與其他腫瘤類型發(fā)病機制類似，HCC發(fā)生發(fā)展與癌基因活化，抑癌基因失活，細胞增殖/細胞凋亡失平衡有關[7]。細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡，由一系列促凋亡基因和抑凋亡基因調控，而腫瘤細胞抑凋亡基因活性增強，促凋亡基因活性降低，細胞趨向于永生化[8]。

在促凋亡蛋白家族中，PDCD5蛋白是我國率先報道的一種重要的促細胞凋亡相關因子[9]。已有報道表明，PDCD5在腫瘤組織中表達減少，通過與P53信號通路作用促進腫瘤細胞凋亡進程，有可能作為相關腫瘤診斷與治療靶點[10-11]。研究表明，與正常組織比較，肝癌細胞中PDCD5 mRNA和蛋白質水平均較低，PDCD5表達與乙肝病毒感染、腫瘤數(shù)、淋巴結轉移和肝癌患者存活時間密切相關，并可作為HCC患者總生存期和無病生存率的預測因子[12-13]。另外，PDCD5基因低表達常誘導其他多種促凋亡因子表達，維持肝癌細胞的化療藥物敏感性，增加抗腫瘤治療效果[14]。另外，細胞凋亡信號通路傳導依賴于下游效應蛋白-Caspase蛋白激活，活化Caspase在細胞中能夠切割400多種功能蛋白底物，如Lamins、信號分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA修復酶等，該重要蛋白質的降解和核酸酶的激活最終導致細胞凋亡。Caspase-3蛋白是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細胞殺傷機制的重要組成部分?；钚訡aspase-3可作用于一些其他Caspase成員，并降解相應的胞漿胞核底物，誘導細胞凋亡，如果Caspase-3活性受到抑制，則出現(xiàn)細胞凋亡異常，從而引起腫瘤產(chǎn)生[15]。研究表明，肝癌細胞HepG2中Caspase-3蛋白活性及蛋白陽性表達率均顯著低于正常肝細胞[16]。HUA等[17]證實，HCC分級越高，癌細胞分化越差，Caspase-3蛋白陽性表達率越低，提示Caspase-3蛋白表達水平與HCC惡性程度呈負相關。

在本實驗中，基于Caspase-3和PDCD5蛋白在肝癌治療與預后中重要作用，筆者利用基因重組技術設計一種能同時靶向過表達上述兩種蛋白的融合基因。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而實現(xiàn)目的基因長期且穩(wěn)定的表達，目前己成為表達外源基因常用載體形式之一。另外，常用的轉染劑，如脂質體和質粒，細胞轉染效率較低，且化學轉染試劑通常存在較明顯的細胞毒性[18]。相比較而言，慢病毒轉染效率與細胞類型相關，一般可達50%～80%[19]。筆者利用人類免疫缺陷型病毒為基礎發(fā)展起來的慢病毒GV358載體，轉染HepG2肝癌細胞，流式細胞儀檢測Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP慢病毒轉染效率高達98.9%，推測這種高轉染效率與細胞類型密切相關，腫瘤細胞活性強，其轉染率隨之升高。成功轉染后，蛋白水平證實轉染后實驗組PDCD5和Caspase-3蛋白表達明顯增強。其次，筆者進一步觀察抑制PDCD5和Caspase-3蛋白過表達對于人HepG2肝癌細胞增殖和凋亡率的影響，結果證實，與未轉染和陰性序列轉染組比較，實驗組細胞增殖速度放緩，表明生長狀態(tài)受到影響。同時，轉染72 h后，實驗組HepG2肝癌細胞早期凋亡率增加，且晚期細胞凋亡率和細胞壞死數(shù)量均增加。

綜上所述，通過慢病毒轉染靶向PDCD5-Caspase-3融合基因過表達作用于人肝癌細胞系HepG2，可增強PDCD5和Caspase-3蛋白表達，降低HepG2肝癌細胞增殖速度，促進HepG2肝癌細胞凋亡，因此有望作為肝癌治療新型潛在靶點。