蘇飛 鄭可 付祎云 吳倩 唐源 王威亞 蔣莉莉

肺癌是世界范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤[1]，也是中國(guó)最常見的惡性腫瘤之一。中國(guó)每年新發(fā)肺癌病例60.95萬，居惡性腫瘤首位[2]。其中，約80%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者。75%患者確診時(shí)已是晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)[3]。目前，表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）已是攜帶EGFR基因敏感突變的NSCLC患者的一線治療用藥[4-8]。及時(shí)、全面了解EGFR突變對(duì)NSCLC患者的治療及預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。

通過活檢或術(shù)后腫瘤組織進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)是現(xiàn)行金標(biāo)準(zhǔn)。但是，臨床實(shí)踐中存在諸多局限，如：腫瘤組織獲取困難、難以重復(fù)取材、以及腫瘤異質(zhì)性等。液體活檢是指以非侵入性或微侵入性方法，通過對(duì)痰液、血液、尿液等體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（cell-free DNA, ctDNA）、循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）和外泌體等進(jìn)行檢測(cè)，從而獲取腫瘤組織生物學(xué)信息的技術(shù)[9]。與組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)、可重復(fù)、患者接受度高等特點(diǎn)。cfDNA是患者血漿中游離的自身DNA片段，由正常及腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡或主動(dòng)分泌進(jìn)入外周血循環(huán)，攜帶生物學(xué)信息與原發(fā)腫瘤具有高度一致性[10]。當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，血漿cfDNA檢測(cè)是EGFR突變分析合適的替代選擇[11]。對(duì)第一代EGFR-TKIs耐藥的肺癌患者中，約50%出現(xiàn)T790M突變。這種耐藥突變可以存在于原發(fā)腫瘤中，更多是出現(xiàn)在治療后二次活檢樣本。顯然，血檢在隨訪、監(jiān)測(cè)方面更具有可操作性。

本研究收集肺癌患者配對(duì)的血液及腫瘤組織樣本進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)分析，旨在探討NSCLC患者血液循環(huán)cfDNA檢測(cè)EGFR基因突變的敏感性和特異性，分析其臨床應(yīng)用以及預(yù)后指導(dǎo)價(jià)值，為臨床常規(guī)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料和樣本收集 收集2014年12月-2017年4月四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科107例肺腺癌患者一一配對(duì)的血液和腫瘤組織樣本，所有配對(duì)的腫瘤組織樣本均取自輔助治療前。收集并分析患者臨床病理特征，包括：性別、年齡、吸煙史、腫瘤類型、分期、治療方式等資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：①病例資料完整；②肝、腎功能及血常規(guī)無明顯異常，無其他并發(fā)惡性腫瘤或器官功能障礙性疾病。③其中，血液樣本包括3組：治療前血液樣本50例，取患者治療前的腫瘤組織標(biāo)本同時(shí)收集血液標(biāo)本，包括活檢組織［計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺和纖維支氣管鏡活檢］38例和手術(shù)切除樣本12例。傳統(tǒng)化療后血液樣本29例，收集患者化療前的活檢腫瘤組織樣本和化療五期后血液樣本；靶向治療后血液樣本28例，收集患者靶向治療前活檢腫瘤組織樣本；對(duì)靶向治療的28例腺癌患者全部進(jìn)行隨訪：隨訪時(shí)間：2014年12月-2017年12月；隨訪中位時(shí)間19.5個(gè)月，隨訪間隔時(shí)間3個(gè)月；隨訪方式：門診隨訪及電話隨訪；隨訪內(nèi)容包括臨床癥狀，體格檢查淋巴結(jié)情況、腫瘤標(biāo)志物水平［癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin-19-fragment,CYFRA21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）等］、影像學(xué)檢查資料等；根據(jù)隨訪情況，判斷為病情進(jìn)展時(shí)，收集患者血液樣本；其靶向治療平均時(shí)間為12個(gè)月。

1.2 組織樣本診斷及DNA的提取 107例配對(duì)組織樣本均由兩位資深病理醫(yī)師（蔣莉莉副主任醫(yī)師，王威亞副主任醫(yī)師）診斷組織學(xué)亞型，必要時(shí)行免疫組化協(xié)助確診［廣譜細(xì)胞角蛋白（pan-cytokeratin, PCK）、細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7, CK7）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（thyroid transcription factor-1, TTF-1）、天門冬氨酸蛋白酶A（noval aspartic proteinase pepsin family A, Napsin-A）、CK5/6、P63、P40、CD56、嗜鉻素A（chromogranin A, CgA）、突觸素（synaptophysin, Syn）和ki-67］。同時(shí)，選擇腫瘤細(xì)胞占比10%以上的蠟塊提取DNA。腫瘤組織DNA的提取采用商品化試劑盒（DNA FFPE Tissue Kit, QIAGEN），樣本濃度和純度使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，確保光密度（optical density, OD）值在1.8-2.0（A260/A280）之間。合格DNA樣本于-20 ℃環(huán)境保存，檢測(cè)時(shí)稀釋至2 ng/μL備用。

1.3 血液樣本的收集及DNA的提取 107例血液樣本均于清晨空腹抽取靜脈血10 mL置于K2E（EDTA）抗凝采血管（BD）中，并于30 min內(nèi)處理：2,000g離心10 min后將上層血漿移至新離心管，再重復(fù)2,000g離心10 min提純；獲得的4 mL-5 mL上清血漿標(biāo)本保存在-80 ℃低溫冰箱，24 h內(nèi)完成cfDNA提?。ㄑ篋NA提取分離試劑盒，艾德，中國(guó)），并于-20 ℃保存待檢。

1.4EGFR基因突變檢測(cè) 成功提取DNA后在3 d內(nèi)進(jìn)行ARMS法（ABI 7500 real-time PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物公司）檢測(cè)EGFR基因突變，包括18-21號(hào)外顯子共29個(gè)突變熱點(diǎn)（ADx-ARMS，艾德，YZB/國(guó)6377-2014）。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)各突變陰性、陽性對(duì)照孔及空白對(duì)照孔，反應(yīng)參數(shù)依據(jù)試劑盒說明書設(shè)定。根據(jù)說明書判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線及CT值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用方差分析；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析。應(yīng)用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析，組間曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征 本組107例肺癌患者的臨床病理特征見表1。其中男女比例為1：1.4；平均年齡58歲（29歲-81歲）；大部分患者無既往吸煙史；超過90%患者屬于肺癌晚期（III期18例，IV期80例）。組織學(xué)類型以低分化腺癌為主。

配對(duì)107例肺癌患者的血液樣本包括3種情況：①未經(jīng)輔助治療（治療前組）患者樣本50例（46.7%）；②傳統(tǒng)化學(xué)治療后（化療組）患者樣本29例（27.1%），包括AC（培美曲塞+卡鉑）化療12例，AP（普萊樂+順鉑）化療17例；③靶向治療（靶向組）患者樣本28例（26.2%），其中以吉非替尼治療24例，特羅凱治療2例，以及凱美納、ADZ9291治療患者各1例。

2.2EGFR總體突變率與類型 107例配對(duì)血液和腫瘤組織樣本均成功進(jìn)行EGFR基因突變分析（ARMS法），與臨床特征分析見表1。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，血液和組織EGFR突變均在晚期肺癌患者，尤其是IV期患者中顯著增高（67.5%和87.5%，P＜0.001，P=0.002）；在女性腺癌患者中突變率較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血漿cf DNA檢出EGFR突變60例，總體突變率為56.1%。突變類型以19號(hào)外顯子缺失（19 deletion, 19Del）（27例，45%）和21號(hào)外顯子突變（L858R）（22例，36.7%）為主；余11例均為雙重EGFR突變（compoundEGFRmutations），包括：19Del T790M雙突變7例（11.7%），L858R T790M雙突變2例，G719X L861Q雙突變和19Del L858R雙突變各1例。

配對(duì)腫瘤組織樣本EGFR突變檢出率略高于血液樣本，達(dá)77.6%（83例）。突變類型包括19Del 44例（53.0%）、L858R 30例（36.1%）以及少見突變18號(hào)外顯子（G719X）突變和20號(hào)外顯子插入突變（20-INS）各1例。另檢出雙重EGFR突變7例，包括：19Del T790M雙突變4例（4.8%），19Del L858R雙突變2例和G719X、S768I各1例。

2.3 血液與腫瘤組織EGFR突變結(jié)果比較 一一配對(duì)比較血液和腫瘤組織樣本的EGFR突變總體情況，完全一致樣本共73例（68.2%），包括49例EGFR突變型和24例野生型。檢測(cè)一致的突變類型包括19Del 27例（55.1%），L858R 21例（42.9%），G719X L861Q雙突變1例。不一致病例34例（表2），主要表現(xiàn)為假陰性：血液樣本呈野生型而組織為EGFR突變型（23例，67.6%）。余11例不一致者均屬于EGFR突變類型差異，主要集中在血液樣本T790M的檢出率更高（9例，81.8%）。同時(shí)，沒有出現(xiàn)血液樣本假陽性病例。因此，血液cfDNA檢測(cè)EGFR基因突變的敏感性為72.3%，特異性為100%。血液檢測(cè)EGFR突變型和野生型的一致率分別為81.7%、48.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示血液檢測(cè)EGFR突變陽性結(jié)果可能更可靠。19Del和L858R突變的一致率分別為61.4%和70%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示血液檢測(cè)兩種突變類型均較可靠。

107例血液樣本依據(jù)治療狀態(tài)分為3組（表2）。①50例治療前患者血液樣本檢出EGFR突變31例（62%），配對(duì)腫瘤組織EGFR突變39例（78%）。兩者EGFR突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.081）。配對(duì)比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全一致樣本37例（74%，3組中最高）。其中19Del突變12例，L858R突變13例，G719X L861Q雙突變1例和野生型11例。檢測(cè)結(jié)果不一致樣本13例，同樣集中在假陰性病例（9例，69.2%）。有趣的是，3例患者治療前血檢即發(fā)現(xiàn)含T790M雙突變，而組織檢測(cè)陰性。②靶向組患者28例。血液檢出EGFR突變19例（67.9%），配對(duì)組織25例（89.3%），兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.051）。與配對(duì)治療前腫瘤組織樣本比較，檢測(cè)結(jié)果一致樣本16例（57.1%，3組最低），其中19Del突變樣本10例，L858R突變樣本3例，野生型3例。具體分析12例不一致病例發(fā)現(xiàn)：假陰性和檢出含T790M雙突變病例各占一半（表2）。③化療組患者29例。血液檢出EGFR突變10例（34.5%，3組最低），配對(duì)治療前腫瘤組織檢出EGFR突變19例（65.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。兩者檢測(cè)結(jié)果一致樣本20例（65.6%），包括19Del突變5例，L858R突變5例和野生型10例。重要的是9例不一致樣本全部屬于假陰性（表2），提示傳統(tǒng)化療后血液EGFR基因突變檢出率顯著降低。

2.4EGFR基因檢測(cè)與靶向治療預(yù)后分析 28例肺癌患者經(jīng)靶向治療后檢測(cè)血液cfDNA了解EGFR基因狀態(tài)，并全部隨訪；依據(jù)血檢結(jié)果分為含T790M雙突變組（6例）和無T790M突變組（13例）：含T790M雙突變組患者平均生存期17.5個(gè)月，無T790M突變組平均生存期29.6個(gè)月，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。生存分析如圖1所示，無T790M突變組的無進(jìn)展生存期（progressionfree survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）均比含T790M雙突變組患者顯著延長(zhǎng)。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，無論男性還是女性，無論＜60歲組還是≥60歲組，含T790M雙突變組預(yù)后均較差（P=0.005）。

進(jìn)一步細(xì)分血檢結(jié)果為19Del突變組、L858R突變組和含T790M雙突變組進(jìn)行預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)19Del突變組患者平均生存期為33.2個(gè)月，L858R突變組平均生存時(shí)間19個(gè)月，含T790M雙突變患者平均生存時(shí)間為17.5個(gè)月。三者的PFS、OS差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。但兩兩對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，19Del突變患者較L858R突變患者和含T790M雙突變患者靶向治療后PFS和OS明顯延長(zhǎng)，而L858R突變與含T790M雙突變患者預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

分子靶向治療已成為肺癌患者常規(guī)治療的重要部分。臨床病理多采用侵入性方法，如活檢或手術(shù)獲取的組織進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)[12]。其優(yōu)點(diǎn)毋庸置疑，但缺點(diǎn)同樣不可忽視。一方面，這些侵入性方法都難以重復(fù)取材并伴有一定風(fēng)險(xiǎn)[13]，并發(fā)癥可達(dá)17%[14]。另一方面，大部分NSCLC患者確診時(shí)已是晚期，近1/3患者無法獲得適用于EGFR檢測(cè)的組織樣本[15]。此時(shí)，血漿cfDNA是肺癌患者EGFR突變檢測(cè)的一種有效的替代選擇。近年來，關(guān)于這方面的研究呈井噴式發(fā)展。本研究對(duì)一組配對(duì)血液和腫瘤組織樣本的EGFR基因進(jìn)行檢測(cè)，比其表達(dá)差異，分析血液cfDNA是否能準(zhǔn)確檢測(cè)EGFR基因突變并監(jiān)測(cè)耐藥基因T790M的變化，指導(dǎo)患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療。

本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用ARMS-PCR法檢測(cè)血液cfDNA的EGFR突變總體一致率為68.2%，方法敏感性為72.3%，特異性為100%，比以往的研究[16]更佳。更有意義的是，我們?cè)谥委熐敖M獲得血檢和組織檢測(cè)最高一致率（74%），最低一致率出現(xiàn)在靶向組（57.1%）。同時(shí)，化療組中發(fā)現(xiàn)血液EGFR突變檢出率明顯低于組織（P=0.018），這與以往報(bào)道化療后EGFR突變率降低[17]相符。這些數(shù)據(jù)均提示術(shù)后輔助治療（傳統(tǒng)化療和靶向治療）可以影響血漿cfDNA構(gòu)成，為了解殘余腫瘤狀態(tài)提供依據(jù)。

進(jìn)一步分析血檢和組織檢測(cè)不一致病例發(fā)現(xiàn)：①治療前組主要表現(xiàn)為假陰性（57.1%, 8/14），提示血檢作為無法獲得原發(fā)腫瘤組織的替代選擇時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎解釋陰性結(jié)果。②靶向組不一致病例一半為假陰性，一半為含T790M雙突變（表2）。同時(shí)，生存分析發(fā)現(xiàn)含T790M雙突變組無論在PFS還是OS均差于無突變組（圖1）。因此，血液cfDNA檢測(cè)EGFR突變能更好地反映治療現(xiàn)狀并提示預(yù)后。另一方面，Camidge等[18]研究發(fā)現(xiàn)接近一半的患者在接受連續(xù)的EGFR-TKI治療后出現(xiàn)繼發(fā)性T790M突變。針對(duì)耐藥突變T790M的第三代EGFR-TKI已進(jìn)入視野，及時(shí)檢測(cè)以及監(jiān)測(cè)用藥后T790M狀態(tài)成為臨床關(guān)注新熱點(diǎn)[19,20]。本研究同樣提示血液cfDNA監(jiān)測(cè)T790M突變也可作為選擇靶向藥物的指針。③化療組不一致病例全部屬于血檢野生型而治療前原發(fā)腫瘤組織為EGFR突變型，提示血檢應(yīng)用于傳統(tǒng)化療后的隨訪監(jiān)測(cè)可能作用局限。

治療前組有3例血液含T790M雙突變而配對(duì)腫瘤組織中陰性的病例以及1個(gè)血檢雙突變（19Del、L858R）而組織單突變（L858R）病例。我們分析出現(xiàn)這種情況可能的原因包括：組織活檢取材過程中存在選擇性偏差，因此局部腫瘤組織與外周血所攜帶生物學(xué)信息不一致[21]；腫瘤組織的異質(zhì)性也可能導(dǎo)致與血漿游離DNA信息差異；呈T790M突變的腫瘤細(xì)胞亞群均有更高增值指數(shù)，易于侵襲性生長(zhǎng)或壞死并釋放DNA入血。因此，本研究提示血漿cfDNA比活檢小組織更能全面反映腫瘤驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)，均化組織異質(zhì)性造成的檢測(cè)偏差，為治療提供更加全面的信息。

表 1 111例肺癌患者配對(duì)血液和腫瘤組織樣本的EGFR突變分析Tab 1 Analysis of EGFR mutation in paired blood and tumor tissue samples from 107 patients with lung cancer [n (%)]

表 2 配對(duì)血液與腫瘤組織樣本EGFR基因檢測(cè)結(jié)果不一致病例Tab 2 Inconsistent results of EGFR mutation detection in matched blood and tumor tissue specimen

圖 1 T790M雙突變組和無T790M突變組患者預(yù)后分析。A：T790M雙突變組和無T790M突變組PFS比較（P=0.006）；B：T790M雙突變組和無T790M突變組OS比較（P=0.003）。Fig 1 Prognostic analysis of patients with T790M double mutation and no T790M mutation.A: Comparison of progression-free survival (PFS) time between T790M double mutation group and T790M free mutation group survival (P=0.006); B: Comparison of overall survival (OS) time between T790M double mutation group and no T790M mutation group (P=0.003).

圖 2 19Del突變組、L858R突變組和T790M雙突變組患者預(yù)后分析。A：19Del突變組、L858R突變組和T790M雙突變組PFS比較（P=0.001）；B：19Del突變組、L858R突變組和含T790M雙突變組OS比較（P＜0.001）。Fig 2 Prognostic analysis of 19Del mutation group, L858R mutation group and T790M double mutation group.A: Comparison of PFS between the 19Del mutation group and the T790M double mutation group (P=0.001); B: Comparison of OS between the 19Del mutation group and the T790M double mutation group (P＜0.001).

分析不同突變類型經(jīng)靶向治療后的無進(jìn)展生存期和總生存期，并對(duì)年齡、性別等方面進(jìn)行分層對(duì)比。結(jié)果顯示無T790M突變患者生存期均較突變患者長(zhǎng)（PFS及OS），并且不受性別和年齡影響。經(jīng)靶向治療的不同EGFR突變類型患者中，19Del突變預(yù)后最佳，較L858R和含T790M雙突變患者PFS和OS明顯延長(zhǎng)；而L858R突變型較T790M雙突變型預(yù)后稍好，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與本研究一致，有文獻(xiàn)[22-25]報(bào)道19Del突變患者靶向治療生存期較L858R突變患者更長(zhǎng)。

綜上所述，應(yīng)用ARMS法檢測(cè)血漿cfDNA的EGFR基因突變是一種特異性高、敏感性好的檢測(cè)方法，適用于晚期治療前肺癌患者的靶向檢測(cè)，是無法獲得組織樣本時(shí)合適的替代物。其優(yōu)勢(shì)在于能全面反映腫瘤EGFR基因狀態(tài)，減少組織異質(zhì)性造成的檢測(cè)偏倚。同時(shí)，適用于應(yīng)用靶向治療后：①監(jiān)測(cè)T790M耐藥突變狀態(tài)，實(shí)時(shí)反映治療效果，指導(dǎo)用藥；②具有預(yù)后價(jià)值等。其局限性在于：①需謹(jǐn)慎解釋陰性結(jié)果；②傳統(tǒng)化療后可能出現(xiàn)假陰性。全面了解這一檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，利于臨床選擇開展相應(yīng)工作及正確解讀結(jié)果。