付紅萍， 楊永麗， 劉夢(mèng)晗， 鄢愛(ài)平， 萬(wàn)益群*,

(1.江西省腫瘤醫(yī)院，江西南昌 330029;檢出限及定量限2.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031;3.南昌大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江西南昌330031；4.南昌大學(xué)分析測(cè)試中心，江西南昌 330047)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，癌癥是引起疾病患者死亡的主要原因之一，并且死亡率每年呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。研究表明，癌癥如能早期發(fā)現(xiàn)，其治愈率可顯著提高。自1978年Herberman在美國(guó)國(guó)立癌癥研究所(NCI)召開的人類免疫及腫瘤免疫診斷會(huì)上，首次提出腫瘤標(biāo)志物(Tumor Marker)概念以來(lái)，腫瘤標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)已廣泛應(yīng)用于臨床，以辨別和追蹤腫瘤的存在和變化。目前，腫瘤標(biāo)志物[2 - 5]的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，某些特異性標(biāo)志物有望應(yīng)用于早期癌癥診斷，進(jìn)而提高某些癌癥的治愈率。相關(guān)研究表明，氨基酸在人體新陳代謝過(guò)程中起著重要的作用，是人體健康狀況的重要參數(shù)指標(biāo)，一些癌癥患者體內(nèi)的酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的含量較正常人會(huì)發(fā)生變化[6 - 8]。對(duì)羥苯基乳酸(4-Hydroxyphenyllactic Acid,PHPLA)、對(duì)羥苯基丙酸(3-4-Hydroxyphenylpropionic Acid,PHPA)以及尿黑酸(2,5-dihydroxyphenylacetic acid,HGA)是酪氨酸的重要代謝產(chǎn)物，因此，研究監(jiān)測(cè)人體體液中PHPLA、PHPA和HGA含量的變化對(duì)癌癥的診斷和治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，關(guān)于酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有光度法[9 - 10]、離子交換色譜法[11 - 13]、液相色譜法[14 - 16]以及氣相色譜法[17 - 19]。其中，氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高和選擇性好等特點(diǎn)，是測(cè)定酪氨酸及其代謝產(chǎn)物常用的方法之一。采用氣相色譜法檢測(cè)酪氨酸代謝產(chǎn)物的研究中，血清中酪氨酸的代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道較多，而對(duì)尿液中酪氨酸的代謝產(chǎn)物研究報(bào)道較少。本文采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了人體尿液中PHPLA、PHPA以及HGA同時(shí)檢測(cè)的新方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，取得了較為滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜儀(美國(guó),Agilent公司)；Agilent 5977A質(zhì)譜儀(美國(guó),Agilent公司)；AP210電子天平(美國(guó),Ohaus公司)；MS2迷你振蕩器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA,純度>99%)、對(duì)羥苯基丙酸(PHPA,純度>98%)購(gòu)自于美國(guó)Acros Organics公司；尿黑酸(HGA)購(gòu)自于東京 Chemical Industry 公司；吡啶(99.8%)購(gòu)自于美國(guó) Aladdin公司；BSTFA+1%TMCS購(gòu)自于美國(guó) Sigma-Alorich公司；色譜純環(huán)己烷、乙腈購(gòu)自于美國(guó)TEDIA公司；高純氦氣(純度>99.999%)；色譜純甲醇購(gòu)于美國(guó)Tedia公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取12.5 mg PHPLA、HGA及PHPA標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，用1%的甲醇溶解并定容，搖勻，配制成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃的冰箱內(nèi)保存。使用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；柱溫：70 ℃保持5 min，以30 ℃/min升至200 ℃保持2 min,以3 ℃/min升至230 ℃保持2 min；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL(不分流進(jìn)樣)；溶劑延遲：5 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度：280 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電子倍增器電壓：1 753 V；采集方式：選擇離子掃描。PHPLA、PHPA和HGA的保留時(shí)間、定量離子以及定性離子如表1所示。

表1 PHPLA、PHPA和HGA的保留時(shí)間、定量離子以及定性離子

1.4 尿樣的采集與處理

健康人尿樣由南昌大學(xué)志愿者提供；癌癥患者尿樣由江西省腫瘤醫(yī)院提供。采集的尿樣于冰箱中冷凍保存。將尿液從冰箱中取出，解凍至室溫，混合均勻，以12 000 r/min離心30 min。取上清液1.0 mL，加入1.0 mL乙腈，渦旋1 min，靜置10 min，12 000 r/min離心10 min。取上清液1.0 mL，氮?dú)獯蹈珊?，加?5 μL吡啶和60 μL BSTFA+1%TMCS，于60 ℃下反應(yīng)1 h后，加入0.5 mL環(huán)己烷，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇

圖1 經(jīng)BSTFA+1%TMCS衍生后的對(duì)羥苯基丙酸(PHPA)、尿黑酸(HGA)和對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA)色譜分離圖Fig.1 Chromatogram of PHPA,HGA,PHPLA,after derivation with BSTFA+1%TMCS1.PHPA(3 mg/L);2.HGA(3 mg/L);3.PHPLA(3 mg/L).

尿樣成分較為復(fù)雜，為使衍生后酪氨酸的代謝產(chǎn)物達(dá)到較好的分離效果，本實(shí)驗(yàn)采用HP-5MS毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離，并對(duì)升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化：(1)70 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃保持2 min，5 ℃/min升至230 ℃保持2 min；(2)70 ℃保持5 min，以15 ℃/min升至200 ℃保持2 min，5 ℃/min升至230 ℃保持2 min；(3)70 ℃保持5 min，以30 ℃/min升至200 ℃保持2 min，3 ℃/min升至230 ℃保持2 min；(4)70 ℃保持5 min，以30 ℃/min升至200 ℃保持2 min，2 ℃/min升至230 ℃保持2 min。對(duì)比分析衍生后的酪氨酸的代謝產(chǎn)物的分離效果及其相應(yīng)響應(yīng)信號(hào)，選擇第(3)種升溫程序作為程序升溫條件，三種化合物色譜分離圖如圖1所示。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

2.2.1衍生劑用量的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20 - 21]，本實(shí)驗(yàn)選擇的衍生劑為BSTFA+1%TMCS。0.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品(各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度均為5 mg/L)氮?dú)獯蹈珊?，分別加入40、50、60、70、80、90、100 μL的BSTFA+1%TMCS衍生劑，如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)衍生劑的用量為60 μL時(shí)，目標(biāo)化合物響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)。

2.2.2衍生時(shí)間的優(yōu)化加入60 μL的BSTFA+1%TMCS衍生劑后，在60 ℃烘箱中分別衍生了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，如圖3所示。結(jié)果表明，當(dāng)衍生時(shí)間為1 h時(shí)，目標(biāo)化合物的峰面積最高。

圖2 BSTFA+1%TMCS用量對(duì)對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA)、對(duì)羥苯基丙酸(PHPA)和尿黑酸(HGA)的衍生效果的影響Fig.2 Effect of the amount of BSTFA+1%TMCS on the derivatization of PHPLA,PHPA and HGAa：PHPLA；b：PHPA；c：HGA.

圖3 衍生化時(shí)間對(duì)對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA)、對(duì)羥苯基丙酸(PHPA)和尿黑酸(HGA)的衍生效果的影響Fig.3 Effect of derivatization time on the derivatization of PHPLA,PHPA and HGA a:PHPLA;b：PHPA；c：HGA.

圖4 衍生化溫度對(duì)對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA)、對(duì)羥苯基丙酸(PHPA)和尿黑酸(HGA)的衍生效果的影響Fig.4 Effect of derivatization temperature on the derivatization of PHPLA,PHPA and HGAa：PHPLA；b：PHPA；c：HGA.

2.2.3衍生溫度的優(yōu)化加入60 μL BSTFA+1%TMCS衍生劑后，分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃的烘箱中衍生1 h，如圖4所示。結(jié)果表明，當(dāng)衍生溫度為60 ℃時(shí)，目標(biāo)化合物的響應(yīng)最大。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

人體尿液中含有較多蛋白，影響目標(biāo)物的分析，所以除去尿液中的蛋白很有必要。實(shí)驗(yàn)考察了采用脲酶和乙腈去除蛋白的效果。結(jié)果表明，當(dāng)使用脲酶除蛋白時(shí)，雖然效果較好，但目標(biāo)物的響應(yīng)信號(hào)減弱；當(dāng)使用乙腈除蛋白時(shí)，對(duì)目標(biāo)物的信號(hào)沒(méi)有影響，且能滿足分析的要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈來(lái)除去尿液中的蛋白。

2.4 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

將PHPLA、PHPA以及HGA的儲(chǔ)備液配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照所選擇的衍生條件進(jìn)行處理，在已優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析，以峰面積(A)對(duì)分析物的濃度(c)繪制校準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，三種化合物的線性范圍均為0.025～3.00 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)在0.9993～0.9995之間。

表2 PHPLA、PHPA和HGA的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 回收率與精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確性，通過(guò)添加三個(gè)不同濃度水平的PHPLA、PHPA和HGA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)尿樣和不加標(biāo)尿樣按照1.4節(jié)進(jìn)行處理，在已優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，結(jié)果如表3所示?；厥章试?4.5%～110.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.0%。

表3 健康人尿液中PHPLA、PHPA和HGA的加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)

ND:not detected.

2.6 樣品的測(cè)定

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。在我國(guó)許多大城市中，乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)上升為女性惡性腫瘤的第一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成為婦女健康的最大威脅。研究表明，人體尿液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的含量與乳腺癌有一定的關(guān)聯(lián)性，但對(duì)于PHPLA、PHPA和HGA與乳腺癌的關(guān)系則研究較少。本文應(yīng)用所建立的分析方法，對(duì)健康組(No.1～30)和乳腺癌患者組(No.31～36)尿液進(jìn)行分析。健康人及乳腺癌患者尿液中三種化合物色譜分離圖如圖5和圖6所示。結(jié)果如表4所示。

圖5 健康人尿液中尿黑酸(HGA)和對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA)色譜分離圖Fig.5 Chromatogram of HGA and PHPLA in urine of healthy human1.HGA,2.PHPLA.

圖6 乳腺癌患者尿液中尿黑酸(HGA)和對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA)色譜分離圖Fig.6 Chromatogram of HGA and PHPLA in urine of breast cancer patients1.HGA,2.PHPLA.

SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)10.03ND0.13190.03ND1.5620.03ND0.13200.04ND0.213NDND0.06210.04ND0.0940.03ND0.08220.03ND0.1150.03ND0.13230.03ND0.056NDND0.06240.03ND1.3170.03ND0.15250.04ND0.0680.03ND0.03260.04ND0.4190.03ND0.06270.03ND0.04100.03ND0.04280.04ND0.22110.03ND0.10290.04ND0.23120.03ND0.07300.03ND0.05130.03ND0.0831NDND1.55140.03ND0.0632NDND1.60

(續(xù)表4)

SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)150.03ND0.0433NDND2.24160.03ND0.07340.19ND1.55170.03ND0.27350.04ND1.60180.03ND0.1836NDND1.55

ND:not detected.

PHPLA、PHPA和HGA分別在健康人和乳腺癌患者的平均濃度如表5所示，健康人與乳腺癌患者尿液中PHPLA和HGA的T-檢驗(yàn)值分別為7.63×10-11和0.15。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺癌患者尿液中PHPLA濃度均明顯高于健康人(p<0.01)；乳腺癌患者尿液中HGA濃度與健康人相比無(wú)明顯差異；健康人和乳腺癌患者尿液中均未檢測(cè)出PHPA。

表5 不同尿樣中PHPLA、PHPA和HGA的平均值(mg/L)

ND:not detected.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，研究建立了人體尿液中對(duì)羥苯基丙酸、尿黑酸和對(duì)羥苯基乳酸的分析新方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了衍生條件，在優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件下，取得了良好的分析結(jié)果，目標(biāo)分析物的相關(guān)系數(shù)在0.9993～0.9995之間，三個(gè)不同加標(biāo)濃度水平下的加標(biāo)回收率在94.5%～110.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，乳腺癌患者和健康人尿液中對(duì)羥苯基乳酸含量有一定的差異性，而尿黑酸則無(wú)明顯差異，對(duì)羥苯基乳酸有可能作為乳腺癌的標(biāo)志物。