張朝軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所， 河南安陽 455000)

棉花是一種雜種優(yōu)勢十分明顯的經(jīng)濟(jì)作物，優(yōu)勢不僅表現(xiàn)在株高增高、葉面積增大、光合產(chǎn)物積累多、積累速度快、果枝數(shù)多、果枝增長迅速等個體營養(yǎng)生長優(yōu)勢，也表現(xiàn)在結(jié)鈴多、鈴重增加等產(chǎn)量優(yōu)勢；在耐高溫、耐濕、耐旱、耐瘠、耐病等環(huán)境適應(yīng)性方面也有顯著優(yōu)勢[1]。棉花生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的雜交種主要是通過人工去雄、人工輔助授粉配制的，如‘中棉所70’[2]。人工制種加大了棉花雜交種成本，嚴(yán)重限制了雜交棉的推廣應(yīng)用。培育雄性不育系是解決棉花雜種優(yōu)勢利用問題的關(guān)鍵。

棉花不育系可以分為胞質(zhì)不育系(CGMS)和核不育系(GMS)兩種。從20世紀(jì)60年代至今，報道的棉花細(xì)胞質(zhì)不育系主要有哈克尼西棉胞質(zhì)不育系(D2-2)[3-4]、亞洲棉(A2) 胞質(zhì)不育系、異常棉(B1) 胞質(zhì)不育系[5-9]、三裂棉胞質(zhì)不育系(D8)[10]、陸地棉(AD1) 胞質(zhì)不育系和海島棉胞質(zhì)不育系(AD2)。恢復(fù)系基因型主要有Rf1和Rf2。Rf1基因既能恢復(fù)CMS-D2的育性，也能恢復(fù)CMS-D8的育性，而Rf2只能恢復(fù) CMS-D8 的育性[11]，Rf1、Rf2已找到連鎖的分子標(biāo)記位點[11-12]。

棉花的核不育系分為兩種類型，一種為核基因控制的不育系，已報道的有17個不同類型，包括ms1、ms2、ms3、ms5ms6[13]、ms8ms9、ms13、ms14、ms15 和 ms16[14]等9個隱性核不育系，以及Ms4、Ms7、Ms10、Ms11、Ms12、Ms17、Ms18和Ms19[15]等8個顯性核不育系。其中，12個是在陸地棉中發(fā)現(xiàn)的，5個發(fā)現(xiàn)于海島棉中。 ms2和 Ms4等為完全不育，ms1和ms3等僅是部分不育，ms8ms9則表現(xiàn)為花藥不開裂。其中的ms5、ms8 和 ms9 等已經(jīng)找到相關(guān)的分子標(biāo)記[16]。Yue等[17]對 ms5ms6 雙隱性不育突變體進(jìn)行了研究，鑒定到了58個差異蛋白。另一種核不育系是受環(huán)境因素調(diào)控的核不育系，目前報道的主要有溫敏不育系和光敏不育系。其中，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的棉花溫敏雄性不育系‘特棉S-1’，在日平均溫度高于27 ℃生長條件下表現(xiàn)為不育[18]。湖北省荊州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院從‘洞A’的雜交后代中選育到了一個光敏不育材料NFBY0408[19]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所利用航天誘變育種技術(shù)培育出新型的棉花光敏雄性不育突變體——‘中 9106’，‘中 9106’ 在光照周期為 13～14.5 h的長日照條件下表現(xiàn)不育，在光照周期為11～12.5 h，日平均溫度大于等于21.5 ℃的短日照條件下生長時表現(xiàn)可育(ZL201110294545.4)。本研究利用棉花大規(guī)模組織培養(yǎng)技術(shù)獲得突變體材料，于2012年在組織培養(yǎng)再生植株后代中發(fā)現(xiàn)不育株。2012～2017年對不育材料進(jìn)行了系統(tǒng)研究，確定為只受光周期誘導(dǎo)的新型光敏不育材料，為棉花種質(zhì)創(chuàng)新提供了特異材料，為棉花雜交制種提供新的技術(shù)途徑。該材料的應(yīng)用將有效降低棉花雜交種制種成本，進(jìn)一步推動中國棉花種業(yè)的發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與地點

采用陸地棉W10組織培養(yǎng)體系(ZL200610089439.1)，利用W10無菌苗的下胚軸組織培養(yǎng)，獲得大量再生植株，從中選擇突變體。 2012年獲得9株不育材料，依據(jù)在海南的表型分為PSM1、PSM2、PSM3、PSM4(photoperiod sensitive male sterility mutant of cotton)突變體。對PSM4在海南三亞市吉陽鎮(zhèn)的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所南繁基地(以下簡稱為三亞)和河南安陽市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗田(簡稱安陽)進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1.2 育性穩(wěn)定性試驗

在安陽大田進(jìn)行PSM4育性穩(wěn)定性試驗，以W10為對照，每個處理1行，設(shè)置3個重復(fù)。分別在7月15～20日、8月15～20日、9月15～20日進(jìn)行自交。每個時期每個處理自交300朵花，用不同顏色的毛線標(biāo)記，同時每個時期隨機(jī)選取50朵PSM4的花，用W10做父本進(jìn)行雜交，10月10日調(diào)查自交、雜交鈴數(shù)。

1.3 安陽光周期響應(yīng)試驗

采用黑絨窗簾布制作長方體遮光罩，遮光罩長100 cm、寬80 cm、高120 cm，為了強(qiáng)化遮光效果和減少光照對箱體內(nèi)溫度影響，在絨布外層加裝1層錫箔紙，用于反光。每個遮光罩可以罩住3株棉花，3個重復(fù)共遮光處理9株棉花，對照為W10。2015年6月15日開始第1次遮光處理，開始遮光時間為16:30和17:40，7月5日結(jié)束處理； 8月5日開始第2次遮光處理，開始遮光時間為17:00和18:20，8月25日結(jié)束； 保證光照時長分別為≤11.5 h和≥12.5 h。持續(xù)處理20 d后觀察育性變化情況。處理期間晚上8:00天黑后將遮陽罩移開，以免干擾棉花夜間生長發(fā)育。開花后觀察散粉情況，并進(jìn)行自交。

1.4 遺傳規(guī)律試驗

選取W10、‘中棉所12’、‘中棉所19’、‘中99668’、‘泗棉3號’、‘新陸早12’等材料與PSM4進(jìn)行正反交，在三亞和安陽觀察F1代育性，2016年在安陽調(diào)查F2代分離規(guī)律。

1.5 開花后花藥石蠟切片觀察

取安陽大田中W10和PSM4植株上取不同發(fā)育時期的花蕾，用FAA固定液固定，24 h以后轉(zhuǎn)入70%乙醇中低溫(4 ℃)保存。再用酒精梯度(70%、85%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，然后經(jīng)滲蠟、包埋，最后進(jìn)行切片，厚度為8 μm，番紅-固綠染色，中性樹膠封片，制成永久切片。用Olympus BX51顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSM4的創(chuàng)制

利用W10無菌苗下胚軸進(jìn)行組織培養(yǎng)， 2011年初獲得的一批再生植株在三亞種植，組織培養(yǎng)再生植株標(biāo)記為E0代，自交后收獲E1代；E1代在三亞種植株行，2012年4月株行混收的E2種植在安陽進(jìn)行性狀觀察，在同一再生植株的后代群體中發(fā)現(xiàn)9株雄性不育株。同年選取不育株上健壯的果枝頂端芽嫁接到W10砧木上，定植到三亞。在三亞發(fā)現(xiàn)嫁接的雄性不育株在12月至次年2月底表現(xiàn)為雄性可育，其他時間表現(xiàn)為雄性不育。將這9株不育株的后代在海南三亞大田種植時，葉色分離為4種，即真葉重度黃化型、輕度黃化型、綠偏黃型和正常綠色類型，分別命名為PSM1、PSM2、PSM3和PMS4，這4種材料有著相同的光敏不育特性(圖1)。本研究僅對葉色正常的PSM4研究進(jìn)展進(jìn)行報道。

2.2 PSM4育性穩(wěn)定性試驗結(jié)果

從表1可以看出，PSM4連續(xù)3年自交，沒有得到一個自交鈴，可見PSM4在整個生育期均表現(xiàn)為自交不育，雄性不育性狀可以穩(wěn)定遺傳給后代。利用PSM4做母本，W10做父本雜交，在整個生育期均能獲得雜交鈴，可見雌性育性不受影響。雜交鈴成鈴率比W10略高，主要是不育株上自交不結(jié)鈴導(dǎo)致單株總鈴數(shù)較少，從而提高了雜交結(jié)鈴率。

2.3 PSM4在安陽的遮光試驗

2015年6月15日和8月5日在安陽大田進(jìn)行了2次遮光試驗。試驗結(jié)果(表2)表明，在第1次遮光處理期間，W10在遮光處理和正常生長條件下均表現(xiàn)為正?？捎⒆越唤Y(jié)鈴，田間觀察不到花粉量和育性變化現(xiàn)象。當(dāng)光周期控制在12.5 h時，遮光的PSM4與大田PSM4植株一樣，觀察不到散粉情況，自交不結(jié)鈴。當(dāng)光周期控制在11.5 h時，PSM4可以觀察到與W10同樣的散粉情況，自交結(jié)鈴；7月15日后可以明顯觀察到PSM4花粉量減少，7月20日后，PSM4重新轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄋ幉婚_裂，無散粉現(xiàn)象，自交不結(jié)鈴。在第2次遮光處理期間，W10仍正常可育，田間觀察不到育性和生長發(fā)育情況差異。在光周期12.5 h處理下，PSM4植株仍然保持花藥不開裂、無花粉的雄性不育狀態(tài)；光周期11.5 h處理條件下，PSM4植株在遮光處理到8月18日開始出現(xiàn)花粉，于8月21日花粉量達(dá)到W10水平，并全部轉(zhuǎn)變?yōu)樽越豢捎?月25日停止遮光處理后， 9月2日后出現(xiàn)花粉量變少，自交仍可結(jié)鈴；到9月7～10日重新轉(zhuǎn)化為雄性不育，直至植株自然死亡，觀察不到花粉，自交不結(jié)鈴。因此，可以推斷PSM4育性完全受光周期調(diào)控，對光周期反應(yīng)十分敏感，育性轉(zhuǎn)變對光周期的響應(yīng)關(guān)鍵期可能在開花前12～15 d，這一現(xiàn)象在其他棉花光敏不育系中未見報道。

表2 PSM4短日照處理育性變化情況

2.4 PSM4育性變化對光周期響應(yīng)的推測

棉花是多年生木本植物，在三亞種植一次可以觀察多年。經(jīng)過2014年5月播種到2016年5月連續(xù)2年觀察PSM4育性轉(zhuǎn)變時間，發(fā)現(xiàn)PSM4在11月15日前后開始出現(xiàn)花粉，并可以自交結(jié)鈴，進(jìn)入可育階段；到第二年3月1日前后，開始出現(xiàn)花粉減少，直至花藥不開裂、花藥上無花粉粒、自交不結(jié)鈴等現(xiàn)象，逐漸進(jìn)入雄性不育階段。因此PSM4在三亞自交可以結(jié)鈴時期為11月下旬到次年的3月上旬。結(jié)合安陽遮光試驗結(jié)果，即花藥敗育出現(xiàn)在開花前約13～15 d，將PSM4育性轉(zhuǎn)變階段前推15 d可能是決定花粉育性的關(guān)鍵時期，結(jié)合三亞日照時數(shù)(表3)可以看出PSM4育性轉(zhuǎn)變的光周期為光照時間11.5 h/黑暗時間12.5 h左右，當(dāng)日照時數(shù)大于12 h時表現(xiàn)為不育，當(dāng)日照時數(shù)在11.5～12 h時是育性轉(zhuǎn)變期，花粉較少，當(dāng)日照時數(shù)小于11.5 h時完全可育。

2.5 PSM4在安陽的花及花藥觀察

圖2顯示，PSM4突變體在安陽種植，表現(xiàn)為花朵略小于W10。萼片、花冠、子房均明顯變小，花藥數(shù)量減少，花藥不開裂。柱頭和正常棉花植株一樣，開花當(dāng)天柱頭隱藏在花藥之中，這與已經(jīng)報道的棉花不育系有明顯區(qū)別。開花第2天，可見對照W10和突變體材料PSM4柱頭略有伸長，均高于花藥；體視顯微鏡觀察結(jié)果顯示，PSM4仍保持花藥不開裂性狀，花藥上觀察不到花粉粒。

表3 PSM4育性轉(zhuǎn)變期海南省三亞市吉陽鎮(zhèn)日照時數(shù)

注：2015年11月11日前為雄性不育時期，11月12日至11月22日為花粉逐漸增多變?yōu)樾坌钥捎龝r期；2016年2月17至2月29日為雄性可育時期，3月1日～3月10日花粉量減少，轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌圆挥?月12日后進(jìn)入不育階段。數(shù)據(jù)來源https://richurimo.51240.com/

Note：The sterile stage before 11 Nov. 2015. The turning stage from sterility to fertility 12 Nov. 2015 to 22 Nov. 2015. The fertile stage 23 Nov. 2015 to 29 Feb. 2016. The turning stage from fertility to sterility 1 Mar. 2016 to 11 Mar. 2016. The sterile stage after 12 MAR. 2016. Data from https://richurimo.51240.com/

另外，取安陽種植的PSM4和W10開花后第2天花藥進(jìn)行石蠟切片觀察(圖3)，沿著花藥絲方向切開定義為縱切圖，與花藥絲垂直方向切開定義為橫切圖。從圖3中可以看出，W10的花藥室完全打開，在花藥固定液處理時，花粉粒已經(jīng)完全被固定液洗脫，沒有花粉粒殘留，說明W10花藥開裂正常，花粉粒能夠完全散出。觀察PSM4的花藥發(fā)現(xiàn)，花粉室不開裂，內(nèi)部殘留的敗育花粉粒清晰可見；殘留的花粉粒細(xì)胞壁上沒有正常花粉粒的刺狀凸起，花粉外壁是絨粘層在單核靠邊期合成并提供物質(zhì)給花粉外層的，而棉花花粉發(fā)育從單核靠邊期到開花約需15 d，這與前面的遮光處理結(jié)果基本吻合?？梢曰菊J(rèn)定PSM4敗育的原因是在長日照條件下，絨粘層的花粉粒外壁物質(zhì)合成受阻導(dǎo)致的。

a、c. W10花朵，b、d. PSM4花朵; e. 體視顯微鏡下W10開花第2天的雄蕊和柱頭；f.體視顯微鏡下PSM4開花第2天的雄蕊和柱頭圖2 PSM4與W10的花形態(tài)比較a,c. The flower phenotype of W10; b,d. The flower phenotype of PSM4; e. The stamen and stigma phenotype of W10 at 2 DPA were observed under stereomicroscope; f. The stamen and stigma phenotype of PSM4 at 2 DPA were observed under stereomicroscopeFig.2 The flower phenotype of PSM4 and W10

2.6 陰雨天氣下 PSM4育性穩(wěn)定性

2017年7～8月連續(xù)20多天的陰雨天氣(表4)，在沒有陽光直射的條件下對20行PSM4進(jìn)行60 d自交處理，共對3 562朵花進(jìn)行自交，沒有獲得一個自交鈴。田間觀察沒有發(fā)現(xiàn)花藥散粉現(xiàn)象。可以推斷PSM4的光敏核不育特性不受長期陰雨天氣的影響。在安陽直到10月20日棉花收獲完成，花藥仍無開裂散粉現(xiàn)象，因此在安陽整個生育期PSM4均表現(xiàn)為雄性不育。

2.7 PSM4育性遺傳規(guī)律

2014年利用PSM4做母本，利用W10、‘中棉所12’、‘中棉所19’、‘中99668’、‘泗棉3號’、‘新陸早12’做父本，在安陽配置雜交組合，各組合F1代在三亞、安陽均可育，育性與父本無差異。2014年冬季對所有組合做正反交，收獲F1代，2015年在安陽、三亞分別種植F1代，F(xiàn)1代均可育，觀察不到雄性不育株。因此，可以推斷PSM4育性受核基因控制，是隱性核不育的一種。各雜交組合F2代在安陽種植，可以分離出不育株，F(xiàn)2代分離情況見表5。經(jīng)x2測驗檢測發(fā)現(xiàn)，除4個F2代分離比沒有達(dá)到顯著水平外，其他雜交組合均達(dá)到顯著水平，基本可以認(rèn)定PSM4雄性不育性狀分離比符合3∶1，為單隱性基因控制。

a. W10花藥開裂縱切;b.W10花藥開裂橫切; c. W10花藥開裂橫切放大；d.PSM4花藥橫切; e. PSM4花藥縱切圖3 開花后1 d花藥切片觀察a. Longitudinal section of dehisced-anther of W10; b. Cross section of dehisced-anther of W10; c. Magnified views from b; d. Cross section of dehisced-anther of PSM4; e. Longitudinal section of dehisced-anther of PSM4Fig.3 Paraffin section of anthers of W10 and PSM4 in 1DPA

表5 2016年安陽F2代分離調(diào)查及χ2檢驗

親本Parent指標(biāo)IndexW10中棉所12 CCRI12中棉所19 CCRI19中99668 Zhong99668泗棉3號 Simian3新陸早12 Xinluzao12父本PSM4 PSM4 as male parent總株數(shù) Number of plants211196234247188217不育株數(shù) Number of sterile plant413447592643符合3∶1的χ2值 χ2 Chi-sequare of 3∶13.20*5.722.76*0.11*11.922.84*母本PSM4PSM4 as female parent總株數(shù) Number of plants200231212194213189不育株數(shù) Number of sterile plant424940384233符合3∶1的χ2值 χ2 Chi-sequare of 3∶11.50*1.57*3.932.75*2.89*5.34

3 討 論

植物雄性不育基因可以是直接阻礙雄性發(fā)育的遺傳因素，也可以是決定雄性發(fā)育需要某種生態(tài)條件的遺傳特性[20]，因此在小麥[21-24]、棉花[16-17，25-26]、水稻[27-29]等作物花發(fā)育的過程中任何代謝受阻或不協(xié)調(diào)均會造成雄性不育。棉花組織培養(yǎng)是通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株[30]，在組織培養(yǎng)過程能引起棉花染色體變異[31-32]。利用棉花組織培養(yǎng)引起的染色體變異可以創(chuàng)制新材料[33]。本研究在國際上首次應(yīng)用棉花組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了一個光敏核雄性不育系品系。本研究再次證明了組織培養(yǎng)體系是一種創(chuàng)制突變體的有效途徑。

PSM4與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所早熟育種課題組通過航天誘變的芽黃光敏不育系‘中 9106 ’有著本質(zhì)的區(qū)別[34-35]?！?106’[25]的芽黃標(biāo)記，主要是子葉和真葉均表現(xiàn)為黃綠色，但隨著葉片葉齡的增長，逐漸變綠，‘中9106’的黃化現(xiàn)象與PSM1、PSM2、PMS3有明顯區(qū)別?！?9106 ’在光照周期為 13～14.5 h的長日照條件下表現(xiàn)不育，能配制雜交組合，生產(chǎn)雜交種；在光照周期為 11～12.5 h，日平均溫度大于等于21.5 ℃的短日照條件下生長表現(xiàn)可育，可通過自交方式繁殖不育系。PSM4育性轉(zhuǎn)變的光照時間為11.5 h，因此在中國全境，包括海南，夏季均可以作為不育系進(jìn)行制種，海南的冬季可以自交繁殖。連續(xù)的陰雨天對PSM4光敏不育性狀性無影響，例如2017年7月10日到8月2日，安陽僅有7月19日為晴天，PSM4沒有觀察到散粉和自交結(jié)鈴現(xiàn)象?！?106’開花后花藥干癟塌陷，PSM4開花后花藥在敗育的時候仍表現(xiàn)為晶瑩飽滿，與正常棉花花藥散粉前一樣，花藥室部位無塌陷。PSM4正常的花朵，十分適合利用昆蟲進(jìn)行雜交制種。

本研究利用棉花組織培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)過大量再生植株的篩選，首次從中獲得了光敏核雄性不育材料，首次證明了利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以創(chuàng)造光敏不育突變體。創(chuàng)制的光敏不育材料PSM4來源于W10，W10來源于‘中棉所24’，曾經(jīng)是中國黃河流域棉花主栽品種，具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，PSM4繼承了‘中棉所24’的優(yōu)良性狀。PSM4在日照時間大于12 h的光周期下表現(xiàn)為雄性不育，在11.5～12 h光周期時表現(xiàn)為育性轉(zhuǎn)變期，在小于11.5 h時表現(xiàn)為可育。因此可以利用兩系法進(jìn)行雜交制種。初步雜交試驗表明，PSM4光敏不育基因為單基因隱性性狀?？傊琍SM4農(nóng)藝性狀優(yōu)良，其光敏不育突變?yōu)殡[性性狀，所有的陸地棉品種(系)均為其恢復(fù)系，有利于雜交種的培育和棉花混選混交育種群體的建立，具有廣闊的應(yīng)用前景。