邵盛男， 王 偉

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090)

抗菌肽(anAtimicrobial peptide)是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類用以防御外來病菌的一系列具有抗菌或殺菌活性的多肽類物質(zhì)，具有廣譜抗菌特性，對(duì)革蘭氏陰性菌、陽性菌，甚至是某些病毒都具有抑制作用[1]。水生動(dòng)物由于特殊的生存環(huán)境，當(dāng)其受傷或遇到病原微生物侵襲時(shí)，迫使其迅速產(chǎn)生各類抗菌物質(zhì)，用以抵御生存環(huán)境中各種有害病源微生物的侵害[2]。已有研究表明從石斑魚中提取的抗菌肽(epinecidin-1)殺菌效果非常好，可取代傳統(tǒng)的抗生素[3]。

21世紀(jì)將是開發(fā)研究水生生化藥物與功能性保健食品的黃金時(shí)代。向水中索取食物、功能蛋白和特殊活性物質(zhì)，已成為世界各個(gè)國家漁業(yè)開發(fā)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。抗菌肽作為新型綠色抗病物質(zhì)，未來將會(huì)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有廣闊的研究和應(yīng)用前景[4]。充分利用水生生物資源，開發(fā)水生生物抗菌肽，這是實(shí)現(xiàn)水生生物資源可持續(xù)性發(fā)展的重要途徑之一。

大口黑鱸(Micropterussalmoniodes)，又名加州鱸魚，原產(chǎn)北美州。20世紀(jì)70年代末引入我國，因生長迅速，肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，深受養(yǎng)殖和垂釣行業(yè)喜歡。自引入我國，大口黑鱸的人工繁殖技術(shù)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷提高，加上種質(zhì)退化等因素，近幾年大口黑鱸的疾病種類不斷增加，發(fā)病范圍不斷擴(kuò)大，危害程度也日趨嚴(yán)重[5]。針對(duì)此種現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)采用乙酸直接從大口黑鱸不同組織器官中粗提抗菌肽，并進(jìn)行抑菌性比較，方法簡單，可操作性強(qiáng)，其理論研究是對(duì)水生生物資源有效利用的初步探索，其數(shù)據(jù)結(jié)果可為大口黑鱸抗菌肽產(chǎn)品的開發(fā)和研究提供理論依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)大口黑鱸的健康養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大口黑鱸，購于水產(chǎn)市場鮮活魚，體質(zhì)量0.5 kg左右，外觀無明顯病變和損傷。

嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌購于中國微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基及藥品配制

1.2.1 嗜水氣單包菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨10 g、牛肉膏3 g 、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 大腸桿菌培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g、牛肉膏3 g 、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2.3 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基

蛋白胨10 g、牛肉膏3 g 、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液(100 μg·mL-1)

稱取牛血清白蛋白25 mg，加水溶解并定容至100 mL，再用蒸餾水稀釋至100 mL待用。

1.2.5 考馬斯亮藍(lán)

將100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85%的H3PO4，配制成母液保存，使用時(shí)加蒸餾水稀釋到1 000 mL。

1.3 樣品預(yù)處理

刮取魚體表黏液放入離心管，冰浴保存。解剖取肝、脾、卵、皮剪碎，放入燒杯內(nèi)稱重備用①。

①注：以上操作均需在冰浴條件下進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)方法及步驟

1.4.1 鱸魚抗菌肽的粗提取——乙酸提取法[6-7]

(1)黏液處理：將體表黏液于4℃，10 000 rpm，離心30 min；取上清液與5%乙酸等體積混合，4℃浸提24 h；4℃，10 000 rpm，離心30 min，取上清液，調(diào)整pH至7， 4℃保存，即為鱸魚黏液生物活性肽的粗提物質(zhì)。

(2)內(nèi)臟組織的處理：將新鮮組織超聲波破碎勻漿，獲得組織勻漿液。在勻漿液中加入等體積的5%乙酸，4℃攪拌過夜，浸提24 h。次日70℃隔水加熱15 min，冰浴冷卻，4℃10 000 r·min-1離心30 min，取上清液。將殘?jiān)貜?fù)操作取上清液。將兩次離心所得上清液合并，調(diào)整pH值為7，10 000 r·min-14℃離心30 min，收集上清液，冷凍干燥后保存在-80℃?zhèn)溆?，即為鱸魚內(nèi)臟抗菌肽的粗提物質(zhì)。

1.4.2 提取物的蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定提取物的蛋白質(zhì)含量。

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6只試管，按表1配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻靜置5 min，20 min內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照，在595 nm測定吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制Tab.1 Standard curve solution preparation

(2)提取物蛋白質(zhì)含量測定

取1支試管加入1 mL蒸餾水做空白對(duì)照，另取1支試管加入1 mL待測蛋白質(zhì)溶液。再分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻靜置5 min，測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算提取液蛋白含量。

計(jì)算公式：樣品中蛋白質(zhì)含量

(μg/g)=C·Vt(W·Vs)-1

(1)

式中，C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的值(μg)；Vt：提取液總體積(mL)；W：樣品鮮質(zhì)量(g)；Vs：測定時(shí)加樣體積(mL)。

1.4.3 抑菌試驗(yàn)

選擇大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌3個(gè)菌種，采用紙片法對(duì)提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將菌種復(fù)蘇并培養(yǎng)，計(jì)算出每mL原始樣品中的菌落數(shù)。再將菌液接種于固體平板培養(yǎng)基上，將滅菌的濾紙片(孔的直徑為6 mm)平鋪于培養(yǎng)基上，取20 μL粗提液滴加在培養(yǎng)基的濾紙片上。嗜水氣單胞桿菌37℃培養(yǎng)24 h，大腸桿菌37℃培養(yǎng)12 h，金黃色葡萄球菌37℃培養(yǎng)16 h，觀察抑菌圈形成，測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測得蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值見表2。以吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由此可知標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量在0～100 μg范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.006 7x-0.003 7，R2=0.994 7。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein

2.2 不同組織蛋白質(zhì)含量測定

經(jīng)檢測大口黑鱸卵粗提物中蛋白質(zhì)含量最高，為2.515 mg·mL-1，皮膚次之，為0.643 mg·mL-1。體表粘液中的蛋白質(zhì)含量最少(表3)。

表3 不同組織蛋白質(zhì)含量Tab.3 Protein content of different tissues (mg·mL-1)

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示：大口黑鱸的肝臟、皮膚提取物質(zhì)對(duì)嗜水氣單胞菌和大腸桿菌有抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性。前兩者均屬革蘭氏陰性菌，后者屬于革蘭氏陽性菌。測量抑菌圈的直徑顯示：針對(duì)不同菌種，肝臟、皮膚粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌作用大于對(duì)大腸桿菌的抑菌活性；針對(duì)不同粗提物質(zhì)，肝臟提取物的抑菌活性大于皮膚提取物。粘液、卵、脾提取物對(duì)革蘭氏陰、陽性菌都無抑菌活性。

表4 不同組織抑菌試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Bacteriostatic experiment results of different tissues

注：+ 代表有抑菌活性，- 代表無抑菌活性或者抑菌活性不明顯

Note:+ means bacteriostatic activity，- means no bacteriostatic activity or no obvious bacteriostatic activity

3 討論

3.1 抗菌肽方法分析

國內(nèi)外研究報(bào)道提取抗菌肽的方法較多，如用乙腈、甲醇、鹽酸、乙酸浸提，其中用乙酸浸提是最常用的方法[8-9]。孟春英[10]應(yīng)用乙酸浸提和甲醇浸提法提取偽刺身體壁中的抗菌肽，結(jié)果顯示最優(yōu)條件下，乙酸提取法抗菌肽的最高得率為2.803%，甲醇提取法抗菌肽的最高得率為1.87%?？梢娨宜峤岱色@得更多的抗菌肽，因此本實(shí)驗(yàn)選取乙酸進(jìn)行抗菌活性物質(zhì)的萃取。而王輝等[11]人采用的是較高濃度的丙酮和甲醇等有機(jī)溶劑提取牙鲆組織中的抗菌活性物質(zhì)，該方法更有利于脂溶性物質(zhì)的萃取，但提取率偏低。

3.2 肝臟提取物抑菌活性分析

有研究表明肝臟中含有多種抗菌活性的肽類，抗菌活性的蛋白(肽)相對(duì)含量在肝臟中都較大。ZHANG等[11]研究表明，虹鱒魚LEAP-2蛋白在肝臟中有大量表達(dá)，對(duì)肝臟粗提物的分離結(jié)果也顯示肝臟樣品中抗菌活性成份較多。RICHARDS 等[12]分別用0.1 %三氟乙酸和60 %乙腈的混合物提取大西洋鮭魚腸、胃、肝臟和粘液抗菌活性物質(zhì)，并檢測其對(duì)E.coli D31的抗菌活性，肝臟粗提物檢測到了最大的抗菌活性。徐同玲等[13]用10 %醋酸對(duì)日本鰻鱺的肝、鰓、脾、膽汁、腎臟和血清中的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行提取，檢測提取物對(duì)腸桿菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌和氣單胞菌屬的抑菌作用，結(jié)果顯示: 肝臟提取物的抑菌性最強(qiáng)，血清提取物的抑菌性最弱，其余為鰓>脾臟>膽汁> 腎臟，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。但王輝等[14]用丙酮和甲醇混合液從牙鲆不同組織(皮膚、鰓、肝臟、腎臟) 提取抗菌肽，比較加熱前后各組織抗菌活性，結(jié)果顯示肝臟活性最小，與本試驗(yàn)結(jié)果不吻合。兩者結(jié)果差異的原因可能有:一是物種的差異；二是提取方法有明顯的差異。

3.3 皮膚提取物抑菌活性分析

魚類免疫機(jī)能的第一道防線是粘液和皮膚，李婷婷等[15]總結(jié)多項(xiàng)研究表明從不同魚類體表粘液提取的抗菌肽均具有一定抗菌活性，而在本試驗(yàn)中并沒有檢測到粘液的抑菌效果，皮膚具有抑菌活性，但活性很弱。分析原因可能是由于粘液組織樣品的取樣較少，加入提取液后最后獲得的提取物并沒有進(jìn)行濃縮導(dǎo)致抗菌物質(zhì)濃度過低，而沒有顯示出抑菌的能力。由于在取樣過程中粘液中含有一定的水分，也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量減少。