霍桂桃 楊艷偉 吳曦 劉甦蘇 李芊芊 周舒雅 柳全明 王三龍 沈月雷 呂建軍 范昌發(fā)

（1. 中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心 藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京 100176；2. 中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所模式動物研究室，北京 100050；3. 百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司，北京 101111）

p53基因作為最為人熟知的抑癌基因，其在腫瘤發(fā)生方面的功能已被深入研究［1］。p53基因的突變不僅發(fā)生于大量人類腫瘤病例中［2］，其功能在動物模型中也不斷被研究驗證。截至目前，由于技術(shù)及成本所限，敲除/點突變/轉(zhuǎn)基因小鼠仍為最廣泛的使用模型［3］。然而，遺傳修飾的小鼠模型在某些方面并不能較好地模擬人類缺失p53基因的表型。例如，在小鼠中敲除p53基因?qū)е滦∈?-6個月時即有腫瘤發(fā)生，腫瘤類型主要為胸腺淋巴瘤［4，5］。而同樣先天性缺失p53基因的李-佛美尼綜合癥患者的腫瘤譜更為多樣，且惡性肉瘤發(fā)生率較高［6］。

相較于小鼠，大鼠在模擬人類疾病方面具有更大的優(yōu)勢［7］。雖然在很長一段時間內(nèi)缺乏用于改造大鼠基因的遺傳學(xué)工具，但隨著近10年分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，鋅指酶、ENU突變技術(shù)及基于胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESC）的同源重組技術(shù)被先后用于制作基因敲除大鼠模型［8，9］。雖然p53基因敲除大鼠可通過ES細胞打靶得到，但在國內(nèi)仍較難獲得。本文基于類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù)制作了p53基因敲除大鼠。TALEN由一個包含核定位信號的N端結(jié)構(gòu)域、一個包含可識別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域，以及一個具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成，通過DNA識別模塊將TALEN蛋白引導(dǎo)至特定DNA序列，在FokI核酸酶的作用下進行切割，切割后形成的雙鏈斷裂或直接修復(fù)造成隨機的堿基插入/缺失，或在有同源臂的目的片段存在條件下發(fā)生同源重組，將目的片段整合入基因組。每一個獨立的TALEN重復(fù)元件包含33-35個氨基酸用于識別特定堿基，通常TALEN元件被設(shè)計為能夠識別長度為14-20 bp的DNA序列。我們在p53基因外顯子2設(shè)計TALEN結(jié)合位點，通過PCR及測序驗證，以高陽性率獲得p53基因敲除大鼠模型。進而，我們對構(gòu)建的p53基因敲除大鼠模型進行了表型分析，目的是研究p53基因敲除后其主要自發(fā)性腫瘤類型以及組織特異性病理改變，以期明確該模型是否可用于腫瘤學(xué)及基因功能研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及實驗環(huán)境 實驗用大鼠均飼養(yǎng)于國家嚙齒類實驗動物種子中心［SCXK（京）2014-0013］，繁育環(huán)境為SPF級，實驗在清潔級環(huán)境中進行，溫度（18-26）℃，相對濕度50%-70%，自動光控（12 h明/12 h暗）。飼料購自北京維通利華，經(jīng)60Co輻照滅菌。飲用水為經(jīng)高壓滅菌的自來水。

本實驗在中國食品藥品檢定研究院實驗動物倫理委員會監(jiān)督下進行。實驗人員均持有北京市實驗動物從業(yè)人員上崗證。實驗設(shè)計符合“3R”原則，動物飼養(yǎng)管理及實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》法規(guī)的要求，實驗結(jié)束后實驗動物處死方法為安樂死。

1.1.2 試劑 TaqDNA聚合酶、DNA連接酶，DNA marker、dNTP、PCR緩沖液、蛋白酶K均購置于由寶生物工程大連有限公司（TaKaRa）。1.5 mL離心管和PCR管及蓋購自于Axygen。

1.1.3 儀器 PCR儀（ABI公司），核酸瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad 公司），離心機（美國Thermo Fisher公司），NanoDrop 2000 /2000C 超微量紫外可見分光光度計（美國Thermo Fisher公司），電子天平（Sartorius，BSA220ZS型），顯微注射儀（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 胞質(zhì)注射及胚胎移植 SD品系母鼠，于4-6周進行超數(shù)排卵。顯微注射前3天16∶00注射PMSG，前1天16∶00注射hCG。隨后與同品系公鼠合籠配種，次日清晨檢栓。顯微注射當日，將有栓母鼠解剖，從輸卵管膨大部中取出受精卵，并用透明質(zhì)酸酶消化為裸卵，將受精卵置于M2培養(yǎng)液滴中37℃，5% CO2培養(yǎng)備用。

顯微注射前1天下午挑選出足夠量的發(fā)情期SD母鼠與結(jié)扎公鼠按照1∶1比例合籠。顯微注射當日晨，取出母鼠查看陰道栓，將見栓的假孕鼠作為0.5天假孕母鼠備用。

冰上解凍TALEN，混合濃度為TALEN left/right 6 ng/μL。并 13 000×g離心 20 min，吸取上清。用口吸管吸取液體從注射針后端注入尖端，進行顯微注射。操作成功的囊胚放入胚胎培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，30-60 min后胚胎恢復(fù)，隨后盡快移植到0.5 dpc假孕母鼠的子宮內(nèi)。

1.2.2 基因型鑒定及測序 仔鼠剪尾后進行蛋白酶K消化并提取基因組DNA。每只鼠尾取100 ng基因組DNA，PCR檢測基因型，引物設(shè)計針對轉(zhuǎn)基因的編碼序列，上游引物為p53 f：5′-TGGCCGACTTCTTGGTTACTTGT-3′， 下 游 引 物為 p53 r：5′-CTCTGAGGCATAGTCAAAGTCCAC-3′。PCR 條件為：95℃ 5 min 變性；95℃ 30 s；62℃ 30 s，72℃ 60 s，30 個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物送諾賽基因公司進行測序。

1.2.3 解剖及組織學(xué)分析 對野生型SD大鼠、雜合子P53敲除SD大鼠及純合子P53敲除SD大鼠進行剖檢。腹腔注射4.5%戊巴比妥鈉進行麻醉（麻醉劑量為45 mg/kg），從腹腔后大靜脈取血完畢后，完全放血處死，然后進行解剖。肉眼觀察并摘取以下組織器官：腦、垂體、甲狀腺（含甲狀旁腺）、頜下腺（含舌下腺）、脊髓（頸胸腰段）、胸腺、胸骨（骨髓）、心臟、主動脈、舌、氣管、食道、肺（含支氣管）、肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、胰腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、結(jié)腸、睪丸、附睪、前列腺（腹葉）、卵巢、子宮、陰道、膀胱、坐骨神經(jīng)、肌肉（大腿骨胳?。?、皮膚、乳腺（僅雌性）、眼球、視神經(jīng)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)及病變部位。睪丸、附睪和眼球用Davidson′s液固定，其它臟器用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定。對固定后組織器官進行取材。所取標本經(jīng)逐級酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、滑動切片機切片（厚約3 μm）、蘇木精-伊紅（HE）染色、封固后進行光鏡鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 p53基因敲除大鼠構(gòu)建

首先設(shè)計一對特異性識別大鼠p53基因外顯子2的TALEN蛋白，識別序列分別為 5′-CTCGTAGCTCGAGGGA-3′和 5′-GTGTCAAAGGTATTCGTA-3′（圖1）。然后對TALEN進行體外轉(zhuǎn)錄，并將TALEN mRNA以10 ng/mL的濃度注射大鼠受精卵并進行胚胎移植（表1）。共注射受精卵67個，注射后存活并移植67個，得到出生仔鼠11只。

圖1 p53基因敲除大鼠TALEN結(jié)合位點

表1 顯微注射方式及仔鼠得率

2.2 p53基因敲除大鼠模型驗證

如果TALEN蛋白對靶位點進行了切割，切割位點通常會發(fā)生非同源重組修復(fù)，導(dǎo)致部分堿基插入或缺失。為了檢測切割效率，我們對sgRNA靶位點進行了擴增并測序。在11只仔鼠中，有10只仔鼠的靶位點發(fā)生非同源重組修復(fù)，選取了其中4只作為首建鼠進行繁育，其基因型見表2。

表2 p53基因敲除首建鼠靶序列測序結(jié)果

由于敲除片段較小，不影響RNA轉(zhuǎn)錄，難以通過熒光定量PCR方法檢測到敲除大鼠中p53基因表達水平降低；另一方面，p53基因蛋白表達水平一般情形下表達水平較低，市售p53抗體難以通過Western blot檢測其表達，除非給予紫外線照射刺激以提高其表達水平，故本文通過分析p53基因敲除大鼠的表型來驗證模型構(gòu)建是否成功。即在6月齡左右，組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明p53基因敲除純合子大鼠的腹腔出現(xiàn)惡性纖維組織肉瘤，腫瘤組織累及肝臟、膀胱、胰腺（表3）。腫瘤組織在鏡下表現(xiàn)為纖維性或梭形細胞交叉排列呈花紋或旋渦狀，細胞多形性及含有較大的多核巨細胞，細胞異型性較大，可見核分裂像（圖2）。其他異常包括輕度腎小管上皮細胞變性、壞死，肺泡腔輕度巨噬細胞浸潤伴色素沉著，睪丸輕度生精細胞減少。

表3 p53基因敲除純合子大鼠自發(fā)性惡性纖維組織肉瘤發(fā)生部位

圖2 惡性纖維組織肉瘤鏡檢結(jié)果

2.3 p53基因敲除大鼠眼睛的病理學(xué)改變

在研究中發(fā)現(xiàn)純合子p53基因敲除大鼠的眼睛中央均可見灰白色云翳狀覆蓋物，或表現(xiàn)為眼球癟小，而非常見的球狀；眼眶呈扁平狀，非常見的圓形。對于純合子而言，外顯率為100%，而同窩野生型SD大鼠及雜合子p53基因敲除大鼠眼睛均未見異常（圖3）。進而對純合子p53敲除大鼠的眼睛進行了組織病理學(xué)檢查。鏡檢（圖4）發(fā)現(xiàn)純合子p53敲除大鼠的視網(wǎng)膜變性（外核層、視桿視錐層、外界膜缺失）及晶狀體纖維排列紊亂。

3 討論

本研究使用TALEN高效地構(gòu)建了p53基因敲除大鼠模型。與文獻報道一致，在p53基因敲除大鼠中，惡性纖維組織肉瘤是主要的自發(fā)性腫瘤類型［10］，而p53基因敲除小鼠則主要發(fā)生淋巴瘤［4］，這一結(jié)果提示腫瘤的發(fā)生具有種屬特異性，這也說明在已經(jīng)建立p53基因敲除小鼠情況下，建立p53基因敲除大鼠模型有其特殊意義。表型的種屬特異性現(xiàn)象也曾在 APC［11］，BRCA2［12］和 MSH6［13］敲除大鼠中被發(fā)現(xiàn)。例如，APC突變大鼠主要發(fā)生結(jié)腸腫瘤，而APC突變小鼠主要發(fā)生小腸腫瘤。這些報道提示相較于p53基因敲除小鼠模型，p53基因敲除大鼠模型可能更為合適用于人類疾病研究。

圖3 純合子p53基因敲除大鼠眼睛發(fā)育異常

圖4 視網(wǎng)膜及晶狀體的鏡檢結(jié)果

雖然p53基因敲除大鼠已經(jīng)通過ENU突變技術(shù)及基于胚胎干細胞（ESC）的同源重組技術(shù)得到，但基于大鼠胚胎干細胞實現(xiàn)成功同源重組及穩(wěn)定遺傳十分困難，而且通過ENU突變篩選工作量大，概率低，具有一定的環(huán)境及操作人員風(fēng)險。因此，我們采用TALEN特異性切割p53基因第2個外顯子，通過非同源重組修復(fù)造成小片段插入/缺失，從而造成基因的移碼突變，并進一步通過檢測腫瘤發(fā)生驗證模型制作成功，與人類李-佛美尼綜合癥患者相類似，p53基因敲除大鼠主要發(fā)生惡性纖維組織肉瘤。

值得一提的是，除了符合預(yù)期的自發(fā)性腫瘤發(fā)生外，我們還觀察到 p53基因全部缺失后SD大鼠眼睛出現(xiàn)發(fā)育異常，表現(xiàn)為眼眶呈扁圓狀，眼球癟小；眼中央覆蓋典型云翳狀物質(zhì)，經(jīng)過簡單觀測，該類大鼠視力較弱，行動也較野生型及p53+/-雜合大鼠遲緩。先前的報道主要集中于對p53基因在腫瘤發(fā)生中的功能領(lǐng)域，而對其在眼睛發(fā)育中的作用報道較少，有報道稱在p53基因敲除小鼠模型中表現(xiàn)出遺傳背景相關(guān)的眼部異常。129/Sv背景的小鼠眼部發(fā)育正常，而C57BL/6背景小鼠表現(xiàn)出眼底血管發(fā)生異常及視網(wǎng)膜褶皺［14］。此外，在8周齡小鼠中，發(fā)現(xiàn)P53蛋白高表達于角膜及結(jié)膜上皮細胞的細胞質(zhì)中及晶狀體上皮細胞的細胞核中，而本研究以及先前在小鼠模型上的報道均提示p53基因缺失可導(dǎo)致眼睛發(fā)育異常，p53基因缺失造成SD大鼠視網(wǎng)膜及晶狀體病變的詳細機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

我們通過TALEN技術(shù)高效地構(gòu)建了p53基因敲除大鼠模型，p53基因敲除純合子大鼠的腹腔出現(xiàn)惡性纖維組織肉瘤，腫瘤組織累及肝臟、膀胱及胰腺。另外，本文首次在生命科學(xué)研究領(lǐng)域廣泛使用的SD大鼠品系中發(fā)現(xiàn)p53基因缺失可導(dǎo)致眼睛發(fā)育異常。我們所構(gòu)建的p53基因敲除大鼠模型除了可用于研究腫瘤發(fā)生機制外，也可用于研究p53基因在眼睛發(fā)育過程中的功能。

致謝：感謝李紅伍在大鼠種群建立及繁育中所做的工作。