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      p53基因敲除大鼠模型的構(gòu)建及表型分析

      2018-09-08 07:56:02霍桂桃楊艷偉吳曦劉甦蘇李芊芊周舒雅柳全明王三龍沈月雷呂建軍范昌發(fā)
      生物技術(shù)通報 2018年8期
      關(guān)鍵詞:純合子小鼠基因

      霍桂桃 楊艷偉 吳曦 劉甦蘇 李芊芊 周舒雅 柳全明 王三龍 沈月雷 呂建軍 范昌發(fā)

      (1. 中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心 藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室,北京 100176;2. 中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所模式動物研究室,北京 100050;3. 百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司,北京 101111)

      p53基因作為最為人熟知的抑癌基因,其在腫瘤發(fā)生方面的功能已被深入研究[1]。p53基因的突變不僅發(fā)生于大量人類腫瘤病例中[2],其功能在動物模型中也不斷被研究驗證。截至目前,由于技術(shù)及成本所限,敲除/點突變/轉(zhuǎn)基因小鼠仍為最廣泛的使用模型[3]。然而,遺傳修飾的小鼠模型在某些方面并不能較好地模擬人類缺失p53基因的表型。例如,在小鼠中敲除p53基因?qū)е滦∈?-6個月時即有腫瘤發(fā)生,腫瘤類型主要為胸腺淋巴瘤[4,5]。而同樣先天性缺失p53基因的李-佛美尼綜合癥患者的腫瘤譜更為多樣,且惡性肉瘤發(fā)生率較高[6]。

      相較于小鼠,大鼠在模擬人類疾病方面具有更大的優(yōu)勢[7]。雖然在很長一段時間內(nèi)缺乏用于改造大鼠基因的遺傳學(xué)工具,但隨著近10年分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,鋅指酶、ENU突變技術(shù)及基于胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESC)的同源重組技術(shù)被先后用于制作基因敲除大鼠模型[8,9]。雖然p53基因敲除大鼠可通過ES細胞打靶得到,但在國內(nèi)仍較難獲得。本文基于類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技術(shù)制作了p53基因敲除大鼠。TALEN由一個包含核定位信號的N端結(jié)構(gòu)域、一個包含可識別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域,以及一個具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成,通過DNA識別模塊將TALEN蛋白引導(dǎo)至特定DNA序列,在FokI核酸酶的作用下進行切割,切割后形成的雙鏈斷裂或直接修復(fù)造成隨機的堿基插入/缺失,或在有同源臂的目的片段存在條件下發(fā)生同源重組,將目的片段整合入基因組。每一個獨立的TALEN重復(fù)元件包含33-35個氨基酸用于識別特定堿基,通常TALEN元件被設(shè)計為能夠識別長度為14-20 bp的DNA序列。我們在p53基因外顯子2設(shè)計TALEN結(jié)合位點,通過PCR及測序驗證,以高陽性率獲得p53基因敲除大鼠模型。進而,我們對構(gòu)建的p53基因敲除大鼠模型進行了表型分析,目的是研究p53基因敲除后其主要自發(fā)性腫瘤類型以及組織特異性病理改變,以期明確該模型是否可用于腫瘤學(xué)及基因功能研究。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 實驗動物及實驗環(huán)境 實驗用大鼠均飼養(yǎng)于國家嚙齒類實驗動物種子中心[SCXK(京)2014-0013],繁育環(huán)境為SPF級,實驗在清潔級環(huán)境中進行,溫度(18-26)℃,相對濕度50%-70%,自動光控(12 h明/12 h暗)。飼料購自北京維通利華,經(jīng)60Co輻照滅菌。飲用水為經(jīng)高壓滅菌的自來水。

      本實驗在中國食品藥品檢定研究院實驗動物倫理委員會監(jiān)督下進行。實驗人員均持有北京市實驗動物從業(yè)人員上崗證。實驗設(shè)計符合“3R”原則,動物飼養(yǎng)管理及實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》法規(guī)的要求,實驗結(jié)束后實驗動物處死方法為安樂死。

      1.1.2 試劑 TaqDNA聚合酶、DNA連接酶,DNA marker、dNTP、PCR緩沖液、蛋白酶K均購置于由寶生物工程大連有限公司(TaKaRa)。1.5 mL離心管和PCR管及蓋購自于Axygen。

      1.1.3 儀器 PCR儀(ABI公司),核酸瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad 公司),離心機(美國Thermo Fisher公司),NanoDrop 2000 /2000C 超微量紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher公司),電子天平(Sartorius,BSA220ZS型),顯微注射儀(Eppendorf公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 胞質(zhì)注射及胚胎移植 SD品系母鼠,于4-6周進行超數(shù)排卵。顯微注射前3天16∶00注射PMSG,前1天16∶00注射hCG。隨后與同品系公鼠合籠配種,次日清晨檢栓。顯微注射當日,將有栓母鼠解剖,從輸卵管膨大部中取出受精卵,并用透明質(zhì)酸酶消化為裸卵,將受精卵置于M2培養(yǎng)液滴中37℃,5% CO2培養(yǎng)備用。

      顯微注射前1天下午挑選出足夠量的發(fā)情期SD母鼠與結(jié)扎公鼠按照1∶1比例合籠。顯微注射當日晨,取出母鼠查看陰道栓,將見栓的假孕鼠作為0.5天假孕母鼠備用。

      冰上解凍TALEN,混合濃度為TALEN left/right 6 ng/μL。并 13 000×g離心 20 min,吸取上清。用口吸管吸取液體從注射針后端注入尖端,進行顯微注射。操作成功的囊胚放入胚胎培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2培養(yǎng),30-60 min后胚胎恢復(fù),隨后盡快移植到0.5 dpc假孕母鼠的子宮內(nèi)。

      1.2.2 基因型鑒定及測序 仔鼠剪尾后進行蛋白酶K消化并提取基因組DNA。每只鼠尾取100 ng基因組DNA,PCR檢測基因型,引物設(shè)計針對轉(zhuǎn)基因的編碼序列,上游引物為p53 f:5′-TGGCCGACTTCTTGGTTACTTGT-3′, 下 游 引 物為 p53 r:5′-CTCTGAGGCATAGTCAAAGTCCAC-3′。PCR 條件為:95℃ 5 min 變性;95℃ 30 s;62℃ 30 s,72℃ 60 s,30 個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物送諾賽基因公司進行測序。

      1.2.3 解剖及組織學(xué)分析 對野生型SD大鼠、雜合子P53敲除SD大鼠及純合子P53敲除SD大鼠進行剖檢。腹腔注射4.5%戊巴比妥鈉進行麻醉(麻醉劑量為45 mg/kg),從腹腔后大靜脈取血完畢后,完全放血處死,然后進行解剖。肉眼觀察并摘取以下組織器官:腦、垂體、甲狀腺(含甲狀旁腺)、頜下腺(含舌下腺)、脊髓(頸胸腰段)、胸腺、胸骨(骨髓)、心臟、主動脈、舌、氣管、食道、肺(含支氣管)、肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、胰腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、結(jié)腸、睪丸、附睪、前列腺(腹葉)、卵巢、子宮、陰道、膀胱、坐骨神經(jīng)、肌肉(大腿骨胳?。?、皮膚、乳腺(僅雌性)、眼球、視神經(jīng)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)及病變部位。睪丸、附睪和眼球用Davidson′s液固定,其它臟器用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定。對固定后組織器官進行取材。所取標本經(jīng)逐級酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、滑動切片機切片(厚約3 μm)、蘇木精-伊紅(HE)染色、封固后進行光鏡鏡檢。

      2 結(jié)果

      2.1 p53基因敲除大鼠構(gòu)建

      首先設(shè)計一對特異性識別大鼠p53基因外顯子2的TALEN蛋白,識別序列分別為 5′-CTCGTAGCTCGAGGGA-3′和 5′-GTGTCAAAGGTATTCGTA-3′(圖1)。然后對TALEN進行體外轉(zhuǎn)錄,并將TALEN mRNA以10 ng/mL的濃度注射大鼠受精卵并進行胚胎移植(表1)。共注射受精卵67個,注射后存活并移植67個,得到出生仔鼠11只。

      圖1 p53基因敲除大鼠TALEN結(jié)合位點

      表1 顯微注射方式及仔鼠得率

      2.2 p53基因敲除大鼠模型驗證

      如果TALEN蛋白對靶位點進行了切割,切割位點通常會發(fā)生非同源重組修復(fù),導(dǎo)致部分堿基插入或缺失。為了檢測切割效率,我們對sgRNA靶位點進行了擴增并測序。在11只仔鼠中,有10只仔鼠的靶位點發(fā)生非同源重組修復(fù),選取了其中4只作為首建鼠進行繁育,其基因型見表2。

      表2 p53基因敲除首建鼠靶序列測序結(jié)果

      由于敲除片段較小,不影響RNA轉(zhuǎn)錄,難以通過熒光定量PCR方法檢測到敲除大鼠中p53基因表達水平降低;另一方面,p53基因蛋白表達水平一般情形下表達水平較低,市售p53抗體難以通過Western blot檢測其表達,除非給予紫外線照射刺激以提高其表達水平,故本文通過分析p53基因敲除大鼠的表型來驗證模型構(gòu)建是否成功。即在6月齡左右,組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明p53基因敲除純合子大鼠的腹腔出現(xiàn)惡性纖維組織肉瘤,腫瘤組織累及肝臟、膀胱、胰腺(表3)。腫瘤組織在鏡下表現(xiàn)為纖維性或梭形細胞交叉排列呈花紋或旋渦狀,細胞多形性及含有較大的多核巨細胞,細胞異型性較大,可見核分裂像(圖2)。其他異常包括輕度腎小管上皮細胞變性、壞死,肺泡腔輕度巨噬細胞浸潤伴色素沉著,睪丸輕度生精細胞減少。

      表3 p53基因敲除純合子大鼠自發(fā)性惡性纖維組織肉瘤發(fā)生部位

      圖2 惡性纖維組織肉瘤鏡檢結(jié)果

      2.3 p53基因敲除大鼠眼睛的病理學(xué)改變

      在研究中發(fā)現(xiàn)純合子p53基因敲除大鼠的眼睛中央均可見灰白色云翳狀覆蓋物,或表現(xiàn)為眼球癟小,而非常見的球狀;眼眶呈扁平狀,非常見的圓形。對于純合子而言,外顯率為100%,而同窩野生型SD大鼠及雜合子p53基因敲除大鼠眼睛均未見異常(圖3)。進而對純合子p53敲除大鼠的眼睛進行了組織病理學(xué)檢查。鏡檢(圖4)發(fā)現(xiàn)純合子p53敲除大鼠的視網(wǎng)膜變性(外核層、視桿視錐層、外界膜缺失)及晶狀體纖維排列紊亂。

      3 討論

      本研究使用TALEN高效地構(gòu)建了p53基因敲除大鼠模型。與文獻報道一致,在p53基因敲除大鼠中,惡性纖維組織肉瘤是主要的自發(fā)性腫瘤類型[10],而p53基因敲除小鼠則主要發(fā)生淋巴瘤[4],這一結(jié)果提示腫瘤的發(fā)生具有種屬特異性,這也說明在已經(jīng)建立p53基因敲除小鼠情況下,建立p53基因敲除大鼠模型有其特殊意義。表型的種屬特異性現(xiàn)象也曾在 APC[11],BRCA2[12]和 MSH6[13]敲除大鼠中被發(fā)現(xiàn)。例如,APC突變大鼠主要發(fā)生結(jié)腸腫瘤,而APC突變小鼠主要發(fā)生小腸腫瘤。這些報道提示相較于p53基因敲除小鼠模型,p53基因敲除大鼠模型可能更為合適用于人類疾病研究。

      圖3 純合子p53基因敲除大鼠眼睛發(fā)育異常

      圖4 視網(wǎng)膜及晶狀體的鏡檢結(jié)果

      雖然p53基因敲除大鼠已經(jīng)通過ENU突變技術(shù)及基于胚胎干細胞(ESC)的同源重組技術(shù)得到,但基于大鼠胚胎干細胞實現(xiàn)成功同源重組及穩(wěn)定遺傳十分困難,而且通過ENU突變篩選工作量大,概率低,具有一定的環(huán)境及操作人員風(fēng)險。因此,我們采用TALEN特異性切割p53基因第2個外顯子,通過非同源重組修復(fù)造成小片段插入/缺失,從而造成基因的移碼突變,并進一步通過檢測腫瘤發(fā)生驗證模型制作成功,與人類李-佛美尼綜合癥患者相類似,p53基因敲除大鼠主要發(fā)生惡性纖維組織肉瘤。

      值得一提的是,除了符合預(yù)期的自發(fā)性腫瘤發(fā)生外,我們還觀察到 p53基因全部缺失后SD大鼠眼睛出現(xiàn)發(fā)育異常,表現(xiàn)為眼眶呈扁圓狀,眼球癟小;眼中央覆蓋典型云翳狀物質(zhì),經(jīng)過簡單觀測,該類大鼠視力較弱,行動也較野生型及p53+/-雜合大鼠遲緩。先前的報道主要集中于對p53基因在腫瘤發(fā)生中的功能領(lǐng)域,而對其在眼睛發(fā)育中的作用報道較少,有報道稱在p53基因敲除小鼠模型中表現(xiàn)出遺傳背景相關(guān)的眼部異常。129/Sv背景的小鼠眼部發(fā)育正常,而C57BL/6背景小鼠表現(xiàn)出眼底血管發(fā)生異常及視網(wǎng)膜褶皺[14]。此外,在8周齡小鼠中,發(fā)現(xiàn)P53蛋白高表達于角膜及結(jié)膜上皮細胞的細胞質(zhì)中及晶狀體上皮細胞的細胞核中,而本研究以及先前在小鼠模型上的報道均提示p53基因缺失可導(dǎo)致眼睛發(fā)育異常,p53基因缺失造成SD大鼠視網(wǎng)膜及晶狀體病變的詳細機制還有待進一步研究。

      4 結(jié)論

      我們通過TALEN技術(shù)高效地構(gòu)建了p53基因敲除大鼠模型,p53基因敲除純合子大鼠的腹腔出現(xiàn)惡性纖維組織肉瘤,腫瘤組織累及肝臟、膀胱及胰腺。另外,本文首次在生命科學(xué)研究領(lǐng)域廣泛使用的SD大鼠品系中發(fā)現(xiàn)p53基因缺失可導(dǎo)致眼睛發(fā)育異常。我們所構(gòu)建的p53基因敲除大鼠模型除了可用于研究腫瘤發(fā)生機制外,也可用于研究p53基因在眼睛發(fā)育過程中的功能。

      致謝:感謝李紅伍在大鼠種群建立及繁育中所做的工作。

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