許越 楊杰 陳聞 侯海軍 李衛(wèi)華 陳春蘭 秦紅靈

摘要：【目的】探討南方紅壤坡地人工林生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌群落結構與豐度的季節(jié)變化特征，為我國南方酸性紅壤丘陵區(qū)生態(tài)修復造林樹種的選擇提供理論依據(jù)和參考?！痉椒ā恳詽竦厮闪趾陀筒枇滞寥罏檠芯繉ο?，在兩年的時間里分季節(jié)采集土壤樣品，利用熒光定量PCR（qPCR）分析土壤細菌的豐度，末端限制性酶切片段長度多態(tài)性（T-RFLP）分析土壤細菌的群落結構?！窘Y果】油茶林的土壤水含量、銨態(tài)氮和可溶性有機碳（DOC）含量及土壤細菌豐度均顯著高于濕地松林土壤（P<0.05，下同），且兩種林地的土壤細菌群落結構也產(chǎn)生明顯分異。土壤細菌豐度和土壤理化性狀隨季節(jié)變化產(chǎn)生波動，但年際間變化規(guī)律不一致。兩種林地土壤四季共有物種占絕對優(yōu)勢，群落結構季節(jié)變化不明顯。土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和DOC含量與土壤細菌群落結構呈極顯著相關（P<0.01）。除油茶林的土壤細菌豐度與土壤水含量呈顯著正相關外，其他環(huán)境因子與細菌豐度間的相關性不顯著（P>0.05）?！窘Y論】樹種不同而誘導的土壤養(yǎng)分狀況變化是調(diào)控土壤細菌群落結構的關鍵因子。在我國南方紅壤丘陵區(qū)，油茶林是一種比濕地松林更有利于提升土壤肥力和維持林地土壤生態(tài)質(zhì)量的造林樹種。

關鍵詞： 南方紅壤；人工林；季節(jié)變化；細菌豐度；群落結構

中圖分類號： S154.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1289-08

0 引言

【研究意義】油茶（Camellia oleifera Abel.）是我國南方紅壤丘陵區(qū)主要的經(jīng)濟樹種，因茶油經(jīng)濟效益高，油茶種植面積逐年增加（羅漢東等，2016）。濕地松（Pinus elliottii Engelin）適應性強、抗旱耐脊薄，造林成活率高，是我國南方重要的造林樹種之一（唐代生等，1998）。不同樹種因根系分泌物和養(yǎng)分吸收規(guī)律等存在差異，可能對土壤環(huán)境質(zhì)量造成不同影響。土壤微生物對土壤環(huán)境變化高度敏感，是評價土壤環(huán)境質(zhì)量的有效生物學指標。因此，對比研究油茶林和濕地松林土壤微生物群落及其生態(tài)功能，可從微生物分子機理揭示不同樹種影響南方紅壤環(huán)境質(zhì)量的內(nèi)在機制。【前人研究進展】林地類型不同或同類型林地發(fā)育階段不同，均會導致土壤微生物群落結構差異。劉麗等（2009）研究了不同發(fā)育階段杉木人工林的土壤微生物群落結構，發(fā)現(xiàn)隨杉木發(fā)育年齡的增長，土壤微生物群落多樣性和豐度顯著增加。汪其同等（2015）對比分析楊樹人工林根際和非根際土壤細菌群落差異，發(fā)現(xiàn)根系對根際微生物的選擇是導致根際微生物群落組成和結構產(chǎn)生顯著差異的重要機制。王巍巍等（2015）采用磷脂脂肪酸法研究凋落物管理對樟子松人工林土壤微生物群落結構的影響，發(fā)現(xiàn)凋落物加倍引起的土壤有機碳和養(yǎng)分增多是微生物量升高的主要原因。鄧嬌嬌等（2017）對比研究遼西半干旱區(qū)油松—蒙古櫟混交林與人工純林的差異，發(fā)現(xiàn)混交林土壤微生物功能多樣性顯著高于人工純林，更有利于樹木的生長發(fā)育；而地下根際效應及地上凋落物不同是造成不同林地土壤微生物結構差異的主要原因。殷萌清等（2017）對比研究紅樹植物人工修復區(qū)與天然區(qū)土壤微生物結構差異，發(fā)現(xiàn)人工林土壤微生物多樣性和豐度均顯著低于天然林。另一方面，季節(jié)變化引起的土壤溫度、濕度和養(yǎng)分含量變化也是驅動土壤微生物變化的重要因子。Myers等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，土壤溫濕度、降雨量、土壤理化性質(zhì)和樹種特性等因素是某一特定林地生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物量季節(jié)變化的主要調(diào)控因子。王國兵等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，受多種生態(tài)因子綜合作用的影響，林地生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物具有明顯的季節(jié)性波動。Patel等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，即使處于同一氣候區(qū)域，不同生態(tài)系統(tǒng)對季節(jié)變化的響應也不同。【本研究切入點】目前，針對南方紅壤區(qū)重要人工林地同一氣候條件下不同林地類型在不同季節(jié)土壤微生物變化特征的研究還較匱乏。【擬解決的關鍵問題】選擇濕地松和油茶林兩種人工林地利用方式，在兩年時間內(nèi)分不同季節(jié)采集土壤樣品，利用熒光定量PCR（qPCR）和末端限制性酶切片段長度多態(tài)性（T-RFLP）分析土壤細菌的群落結構對人工林樹種和季節(jié)變化的響應，評價油茶林和濕地松林對土壤環(huán)境質(zhì)量的影響，以期為我國南方酸性紅壤丘陵區(qū)生態(tài)修復造林樹種的選擇提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1. 1 研究區(qū)概況

本研究在中國科學院桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站進行，試驗站位于湖南省桃源縣漳江鎮(zhèn)寶洞峪村（東經(jīng)111°26′，北緯28°55′），年均氣溫16.5 ℃，年降水量1440 mm，日照時數(shù)1520 h，土壤類型為第四紀紅土發(fā)育的紅壤。

1. 2 試驗方法

中國科學院桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站坡地不同利用方式長期定位觀測試驗于1995年開始，在場內(nèi)選擇一處坡面（坡長62 m，坡度8°～11°，投影面積1 ha）作為坡地不同利用方式長期定位觀測試驗區(qū)。試驗區(qū)內(nèi)每種土地利用方式投影面積20 m×50 m。試驗前（1995年）土壤基本理化性狀為：pH 4.45，有機質(zhì)28.9 g/kg，全氮1.93 g/kg，全磷0.66 g/kg，全鉀1.39 g/kg（秦紅靈等，2011）。

土壤樣品采自坡地不同利用方式長期定位觀測試驗場濕地松林和油茶林，兩種人工林試驗區(qū)內(nèi)分別設位于相同坡位的3個小區(qū)（50 m×5 m）作為重復樣地。1995年濕地松和油茶種植后保持無任何人工擾動，到2012年兩種林地的土壤基本理化性質(zhì)已發(fā)生改變（表1）。

1. 3 土壤樣品采集及理化性狀測定

土壤樣品采集于2012年10月20日，2013年1月17日、4月12日、7月9日和10月22日，2014年1月19日、4月3日，7月19日。1、4、7和10月分別代表冬天、春天、夏天和秋天，不同年際樣品作為采樣重復。每小區(qū)S形多點采集0～20 cm土壤樣品，共采集48個土壤樣品（2樹種×4采樣季節(jié)×2采樣年×3重復樣地）。土壤樣品使用滅菌工具采集，防止除土壤樣品外的其他物品與土樣接觸，防止雜菌污染及土壤樣品間的交叉污染，樣品采集時去除林地表層凋落物及明顯的石塊和植物根系。采集完后混勻，一部分土樣（100 g）用液氮冷凍后于-80 ℃保存，用于分子生物學研究，另一部分土樣（400 g）用于常規(guī)分析。

采樣當天利用地溫計測定5 cm土層土壤溫度。利用烘干法測定土壤水含量。用1.0 mol/L KCl溶液浸出土壤懸浮液，過濾后用流動注射系統(tǒng)（FIAstar 5000，F(xiàn)oss Corporation，Hillerod，Denmark）分析土壤氨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量；用0.5 mol/L K2SO4浸提土樣，過濾后用全氮儀（TOC-VMP，Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan）測定土壤可溶性有機碳（DOC）含量。

1. 4 分子生物學分析

1. 4. 1 DNA提取 DNA提取參照楊建和洪葵（2006）的SDS-GITCPEG方法，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA片段大小，并用NanoDrop核酸蛋白儀（ND-1000）測定DNA濃度及質(zhì)量。

1. 4. 2 qPCR檢測分析 采用16S通用引物1369F/1492R在熒光定量實時PCR儀（ABI 7900，F(xiàn)oster City，CA，USA）上進行定量擴增細菌16S rRNA，引物信息見表2。qPCR反應體系10.0 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM 5.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 μg/μL DNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，進行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。標準曲線建立參照Chen等（2012）的方法，標準曲線R2=0.992，擴增效率90%。每個樣品3次平行。為消除不同批次擴增的機械誤差，將每個基因的樣品放置在同一塊384孔板上進行。

1. 4. 3 T-RFLP分析 采用16S通用引物27F/1492R擴增細菌16S rRNA，其中上游引物5'端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標記，用于T-RFLP分析（表2）。反應體系25.0 μL：Taq DNA聚合酶緩沖液2.5 μL，12.5 mmol/L MgCl2 5.0 μL，5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L正向和反向引物各2.0 μL，模板100 ng，Taq DNA聚合酶1 U，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性35 s； 95 ℃ 5 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進行5個循環(huán)；95 ℃ 5 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進行5個循環(huán)； 95 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進行35個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。末端熒光標記的產(chǎn)物用MspⅠ進行消化，其中酶20 U，10×Buffer 5 μL，DNA 500 ng，37 ℃下消化2 h，然后升溫至65 ℃將酶滅活10 min。酶切產(chǎn)物的T-RFLP分析由上海桑尼生物技術有限公司完成。T-RFLP圖譜中限制性片段（T-RF）范圍在50～550 bp，在平行試驗圖譜中重復再現(xiàn)的峰納入統(tǒng)計分析，并去除OTU豐度<1%的T-RFs。T-RFLP圖譜中每個限制性片段（T-RF）為一個OTU，T-RFs片段大小±1 bp被認為是同一個OTU。

1. 5 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析前細菌豐度數(shù)據(jù)通過lg轉化為正態(tài)分布，使用SPSS 10.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述、雙因素方差分析（Two-way ANOVA）和Pearson相關分析，并利用Canoco v.4.5冗余分析土壤理化性質(zhì)對土壤細菌群落結構的影響，蒙特卡洛檢驗顯著性。

2 結果與分析

2. 1 人工林生態(tài)系統(tǒng)土壤理化性狀的季節(jié)變化動態(tài)

雙因素方差分析結果（表3）表明，油茶林和濕地松林土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和DOC含量存在顯著差異（P<0.05，下同），土壤溫度、土壤硝態(tài)氮和DOC含量受季節(jié)變化的影響顯著。受季節(jié)大氣溫度變化的影響，濕地松林和油茶林的土壤溫度呈明顯的季節(jié)變化規(guī)律，但兩種林地的土壤溫度無明顯差異，夏季最高溫在25 ℃左右，冬季最低溫在7 ℃左右（圖1-A）。兩種林地的土壤水含量走勢趨于一致，采樣第一年秋季水含量最高，采樣第二年夏季最高，季節(jié)變化規(guī)律不明顯，且年際間變化趨勢不一致（圖1-B）。土壤硝態(tài)氮含量濕地松林高于油茶林（圖1-C），土壤銨態(tài)氮和DOC含量則相反（圖1-D和圖1-E）。進一步的相關性分析發(fā)現(xiàn)，濕地松林硝態(tài)氮含量與土壤溫度（r=0.51）和土壤水含量（r=0.64）呈極顯著正相關（P<0.01，下同）。

土壤基本理化性質(zhì)也受到樹種的影響，油茶林土壤有機質(zhì)和全氮含量均高于濕地松林，但土壤有效鉀和全鉀含量濕地松林高于油茶林（表1）。

2. 2 人工林生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌群落結構的季節(jié)變化動態(tài)

根據(jù)酶切獲得的16S rRNA片段T-RFLP圖譜（圖2-A）可知，濕地松林和油茶林細菌群落組成存在明顯差異，但各林地土壤細菌群落季節(jié)變化均不明顯。濕地松林土壤中大于10.00%相對豐度的優(yōu)勢16S rRNA片段是90和148 bp，有2個優(yōu)勢種群，相對豐度分別為23.06%和12.64%；油茶林土壤中優(yōu)勢16S rRNA片段是90、148和180 bp，有3個優(yōu)勢種群，相對豐度分別為31.08%和12.68%和11.02%。某些相對豐度較少的16S rRNA片段在兩種林地系統(tǒng)間也產(chǎn)生明顯差異，如192、214、216、266、280、434和468 bp只在濕地松林土壤出現(xiàn)，而130、146、156、228、262、286、428、430、474和476 bp只在油茶林土壤出現(xiàn)。

冗余分析（RDA）結果（圖2-B）表明，前兩個主成分分別解釋變量的85.4%和10.0%，濕地松林和油茶林土壤細菌群落分別聚類于圖的左右兩側，在第一主成分上明顯分異；不同季節(jié)土壤細菌群落聚類不明顯。維恩分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，濕地松林和油茶林四季共有物種占絕對優(yōu)勢。濕地松林第一個采樣年（S1）四季共有物種18種，占總物種數(shù)的58.1%，占物種豐度的92.7%；第二個采樣年（S2）四季共有物種22種，占總物種數(shù)的71.0%，占物種豐度的97.5%；油茶林第一個采樣年（Y1）四季共有物種18種，占總物種數(shù)的58.1%，占物種豐度的91.5%；第二個采樣年（Y2）四季共有物種19種，占總物種數(shù)的54.3%，占物種豐度的93.4%。

2. 3 人工林生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌豐度的季節(jié)變化動態(tài)

雙因素方差分析結果（表3）表明，油茶林和濕地松林土壤細菌豐度差異顯著，但季節(jié)變化不明顯。由圖4可看出，除第一年春季外，其他季節(jié)油茶林的土壤細菌豐度均高于濕地松林；兩種林地的土壤細菌豐度隨季節(jié)變化產(chǎn)生波動，但年際間季節(jié)變化趨勢不一致，第一年秋季和冬季明顯高于春季和夏季；第二年呈秋、冬、春和夏逐步增加的趨勢。

2. 4 人工林生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌組成季節(jié)變化與土壤因子的關系

蒙特卡洛檢驗結果（表4）顯示，土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和DOC含量與土壤細菌群落結構極顯著相關，是影響土壤細菌群落結構的關鍵環(huán)境因子，分別解釋群落結構變化的27.42%、19.91%和12.58%。對濕地松林和油茶林土壤細菌豐度與土壤環(huán)境因子進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，除油茶林土壤細菌豐度與土壤水含量呈顯著正相關外，其他環(huán)境因子與細菌豐度間的相關性不顯著（P>0.05）。

3 討論

盡管研究區(qū)域、管理方式和氣候條件均相同，不同樹種對林地生態(tài)系統(tǒng)土壤養(yǎng)分狀況及土壤微生物產(chǎn)生的影響也存在差異。Kelty（2006）在研究落葉林、針葉林和針闊混交林3種林地類型土壤養(yǎng)分狀況時發(fā)現(xiàn)，針葉林的土壤生產(chǎn)力顯著低于落葉林和針闊混交林。鄭華等（2006）在我國南方紅壤區(qū)對不同林地類型的土壤生物學特性進行研究，發(fā)現(xiàn)油茶林具有更高的林下植被生物和根系生物量，導致土壤有機質(zhì)含量高于濕地松林，細菌數(shù)量則顯著高于濕地松林。本研究分析了油茶林和濕地松林的土壤理化性狀，發(fā)現(xiàn)兩種林地土壤表層有機質(zhì)、全氮、銨態(tài)氮和DOC含量均表現(xiàn)為油茶林高于濕地松林，且與土壤養(yǎng)分狀況一致，油茶林土壤細菌豐度也顯著高于濕地松林。胡承彪等（1990）研究表明，林地生態(tài)系統(tǒng)中林型、植被、林分組成和土壤有機質(zhì)含量等生態(tài)因素是影響土壤微生物數(shù)量的關鍵因素。濕地松屬于針葉林，針葉中含有大量細菌難以分解利用的物質(zhì)（單寧、樹脂、纖維素和木質(zhì)素等），土壤細菌因得不到充足的養(yǎng)分而無法進行大量繁殖；油茶林屬于闊葉林，落葉殘體含有大量容易被細菌分解利用的物質(zhì)（氮素和水分等），充足的養(yǎng)分條件有利于大量細菌繁殖（楊尚東等，2014）。同時，油茶林較高的凋落物和根系分泌物進入土壤，為土壤細菌的生長提供了更多的營養(yǎng)物質(zhì)來源，進而增加了土壤細菌的數(shù)量（Haichar et al.，2014）。

除土壤細菌數(shù)量外，土壤細菌群落結構在油茶林和濕地松林間也產(chǎn)生明顯分異。土壤地下微生物群體的數(shù)量和種類隨地上植物種類的變化而發(fā)生變化，不同植物種類其歸還土壤物質(zhì)的數(shù)量和類型不同，造成土壤細菌群落結構的不同（Zhong and Makeschin，2006）。本研究發(fā)現(xiàn)土壤有效態(tài)養(yǎng)分含量（土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和DOC含量）與土壤細菌群落結構密切相關，且在兩種人工林間存在顯著區(qū)別。因此推測由于樹種不同而誘導的土壤養(yǎng)分狀況變化是調(diào)控土壤細菌群落結構的關鍵因子。方昉等（2007）的研究也表明，土壤微生物數(shù)量與土壤酶活性總體呈正相關，而土壤酶主要來源于土壤微生物的代謝過程。由此可知，我國南方酸性紅壤坡地油茶林對土壤物質(zhì)的轉化能力優(yōu)于濕地松林。

季節(jié)變化對土壤細菌群落結構和豐度的影響明顯小于林地樹種不同造成的影響。盡管已有許多研究表明土壤微生物群落結構和豐度等受季節(jié)變化的顯著影響，但研究結果并未得到相對統(tǒng)一的規(guī)律（Edwards and Jefferies，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)土壤細菌數(shù)量較高的季節(jié)基本出現(xiàn)在夏秋季，可能是因為夏秋季適宜的土壤溫度、充足的水分狀況為土壤微生物的生長提供了合適的土壤環(huán)境（Yang et al.，2010）；而兩種林地的土壤細菌豐度在4～5月達低谷，可能是由于此時未到雨季，導致土壤細菌活性降低，非優(yōu)勢種群減少（Davidson et al.，2000）。此外，樹木生長發(fā)育與土壤微生物對養(yǎng)分的利用間存在的競爭和互相促進關系，也可能造成土壤微生物對季節(jié)變化的響應不一致（Wardle，1992）。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)油茶林和濕地松林土壤硝態(tài)氮含量隨季節(jié)的變化趨勢明顯不一致，從兩種林地的土壤硝態(tài)氮含量來看，濕地松林土壤硝態(tài)氮含量與土壤溫度和水分含量呈顯著正相關，說明濕地松林土壤的硝化作用明顯受以上兩個因素的影響；油茶林的土壤硝態(tài)氮含量相對較穩(wěn)定，說明油茶林土壤中的硝化強度與反硝化強度相當；而濕地松林的土壤硝態(tài)氮與氨態(tài)氮含量走勢相反，可能是濕地松林的硝化過程起主導作用。土壤的硝化反硝化作用受土壤pH、有機質(zhì)含量、CO2、溫度、氮素、水分含量和剖面深度等因素影響（劉若萱等，2014）。本研究通過16S rRNA片段分析土壤細菌時無法區(qū)分氮素轉化功能微生物在兩種林地生態(tài)系統(tǒng)受季節(jié)變化和樹種的影響，因此下一步有必要利用功能基因，針對氮素轉化過程開展相關研究。

4 結論

樹種不同而誘導的土壤養(yǎng)分狀況變化是調(diào)控土壤細菌群落結構的關鍵因子。油茶林和濕地松林均是我國南方紅壤丘陵區(qū)用于防止水土流失、改良生態(tài)環(huán)境的造林先鋒樹種，但油茶林在改良林地表層土壤養(yǎng)分、維持土壤微生物多樣性方面優(yōu)于濕地松林。因此，在我國南方紅壤丘陵區(qū)，油茶林是一種比濕地松林更有利于提升土壤肥力和維持林地土壤生態(tài)質(zhì)量的造林樹種。

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（責任編輯 王 暉）