探討建立大鼠半乳糖性白內(nèi)障模型的方法

鐘蕾　王婷　王濤　黎韋華　凌士奇

【摘要】目的探討建立大鼠半乳糖性白內(nèi)障模型的方法。 方法48只大鼠，隨機分為8組，每組6只，雙眼均為觀察眼，采用腹腔注射法建立大鼠半乳糖性白內(nèi)障。每日對每只大鼠進行稱量，A組：50%D半乳糖10 g/（kg·d）；B組：50%D半乳糖15 g/（kg·d）；C組：50% D半乳糖10 g/kg，每日2次；D組：50% D半乳糖15 g/kg，每日2次；E、F、G、H的注射劑量等同對應(yīng)A、B、C、D組，A、B、C、D組在第10日開始加喝10% D半乳糖水。每3 d用裂隙燈觀察晶狀體的渾濁程度一次。結(jié)果觀察至第30日時，除最低劑量的E組（3333%）外，各實驗組的造模成功率均為100%，A～H各組的死亡率（%）分別為0、3333、6667、3333、0、1667、0、1667。總死亡率為2083%，造模成功率為7083%。結(jié)論腹腔注射半乳糖可以成功建立白內(nèi)障動物模型，且造模的成功率較高，死亡率較低，是較穩(wěn)定的半乳糖白內(nèi)障動物模型。

【關(guān)鍵詞】半乳糖；白內(nèi)障；大鼠

Investigation of the method of establishment of rat models with galactose cataractZhong Lei， Wang Ting， Wang Tao， Li Weihua， Ling Shiqi Department of Ophthalmology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University，Guangzhou 510630， China

Corresponding author，Ling Shiqi， Email：lingshiqi123@163com

【Abstract】ObjectiveTo explore the method of establishment of rat models with galactose cataract MethodsFortyeight rats were randomly divided into 8 groups（n= 6） Bilateral eyes were regarded as the observation eyes The rat models with galactose cataract were established by intraperitoneal injection Each rat was weighed daily In group A， 50% Dgalactose 10 g/kg was administered once daily In group B， 50% Dgalactose 15 g/kg was given once daily In group C， 50% Dgalactose 10 g/kg was administered twice daily In group D， 50% Dgalactose 15 g/kg was injected twice a day The injection doses in groups E， F， G and H corresponded to those in groups A， B， C and D， respectively In groups A， B， C and D， 10% Dgalactose water was supplemented on the 10th day The opacity of lenses was observed by the slitlamp biomicroscope every 3 d ResultsOn the 30th day， the success rate of each group was 100%， except for the group E （3333%） in which the lowest dose was administered The mortality rates in groups AH were 000%，3333%，6667%，3333%，000%，1667%，000%，1667%， respectively The total mortality rate was 2083%， and the success rate of model establishment was 7083% ConclusionIntraperitoneal injection of galactose can successfully establish the animal models of cataract with high success rate and low mortality rate The established rat model with galactose cataract is relatively stable

【Key words】Galactose； Cataract； Rat

糖尿病患者在2013年約達382億，2035年預(yù)計達到592億[1]。白內(nèi)障是糖尿病的最常見并發(fā)癥之一，更值得重視的是，白內(nèi)障已被確定為全球視力障礙和失明的主要原因。對于臨床研究與治療，積極尋找病因是治療及預(yù)防疾病最關(guān)鍵的步驟，因此建立穩(wěn)定可靠的動物模型進行實驗研究，有助于日后降低視力損害及白內(nèi)障盲的發(fā)病率[2]。半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型已廣泛應(yīng)用，是較好反映人類糖尿病性白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障的動物模型。半乳糖模型的建模方法一直存在爭議，國外學(xué)者認為腹腔注射不能夠形成糖性白內(nèi)障[3]。但是在該領(lǐng)域，我國早期的一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)腹腔注射半乳糖可誘發(fā)白內(nèi)障的形成，還有學(xué)者采用球后注射、皮下注射等方法誘發(fā)白內(nèi)障，造模的方式、方法與劑量都不相同，且引起的動物死亡率較高，基本達半數(shù)以上[4]。我們經(jīng)過一系列的實驗摸索，探討半乳糖的用量及方法，旨在提供穩(wěn)定可靠且死亡率較低的白內(nèi)障動物模型制備方法，為日后白內(nèi)障的實驗研究及治療提供一個參考方案。

材料與方法

一、實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠3～4周齡48只（中山大學(xué)中山眼科動物實驗中心提供），體質(zhì)量80～100 g，復(fù)方托吡卡胺散瞳后，裂隙燈下晶狀體澄清透明且無其他眼部疾病。檢查實驗動物的使用遵循國家《實驗動物管理條例》及通過動物倫理委員會的批準。

二、藥品與器材

D半乳糖（Genview），滅菌水（中國大冢制藥有限公司），復(fù)方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會社）； SLD7/DC3/IMAGEnet裂隙燈（日本Topcon公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），體重秤（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

三、分組

經(jīng)普通顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，48只大鼠隨機分為8組，每組6只。為了減少左右眼可能發(fā)生差異對實驗結(jié)果的影響，我們對實驗中的大鼠進行了雙眼的觀察研究。各組標為A、B、C、D、E、F、G、H。

四、大鼠半乳糖性白內(nèi)障模型的制作

每天注射前對每只大鼠稱取體質(zhì)量，體質(zhì)量精確到小數(shù)點后1位，嚴格按照相應(yīng)體質(zhì)量的劑量進行注射。實驗劑量如表1所示，實驗周期共30 d。

表1實驗方法及劑量分組腹腔注射50% D半乳糖劑量A、E10 g/（kg·d）B、F15 g/（kg·d）C、G10 g/kg，每日2次D、H15 g/kg，每日2次注：A、B、C、D組第10日開始加喝10% D半乳糖水。

五、裂隙燈照相

不使用麻醉劑及任何鎮(zhèn)靜藥的狀態(tài)下，每3 d用復(fù)方托吡卡胺滴雙眼散瞳后，在SL130裂隙燈對大鼠進行晶狀體渾濁程度的觀察并記錄及拍照，直至實驗結(jié)束。使用裂隙燈觀察者共3名，均為有熟練眼科臨床經(jīng)驗且不知曉本次實驗內(nèi)容及進程者，裂隙燈觀察采用彌散光照射法[5]。

六、晶狀體渾濁程度的指標

根據(jù)國際公認的白內(nèi)障分級，共分為8級[6]。具體如下：0級，晶狀體完全透明，未見任何混濁；1a級，晶狀體出現(xiàn)赤道部環(huán)樣水泡；1b級，空泡覆蓋前皮質(zhì)層的范圍≥1/3； 1c級，空泡覆蓋前層皮質(zhì)范圍≥2/3； 2a級，前層皮質(zhì)有部分范圍透明且仍有空泡存在； 2b級，前層皮質(zhì)仍有部分透明范圍，但不伴有空泡的存在；3級，均一的皮質(zhì)性混濁；4級，晶狀體核出現(xiàn)混濁。

3名觀察者對大鼠白內(nèi)障渾濁程度進行評級，統(tǒng)計后改成相對應(yīng)分數(shù)，并采用的渾濁指數(shù)進行換算，并取平均值[7]。渾濁指數(shù)=（各級白內(nèi)障的得分×相應(yīng)分級的眼數(shù)）/組內(nèi)總眼數(shù)。

七、 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 230進行統(tǒng)計分析，用ShapiroWilktest分析數(shù)據(jù)正態(tài)性，非正態(tài)分布定量資料用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，左右眼渾濁指數(shù)比較采用符號秩和檢驗，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。8個劑量組之間的渾濁指數(shù)比較用H秩和檢驗，并采用Bonferroni法進行兩兩對比，P<005/比較次數(shù)（005/C28=00018）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Spearman秩相關(guān)分析左右眼渾濁指數(shù)與體質(zhì)量的相關(guān)性，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、大鼠體質(zhì)量變化

我們每天造模前對大鼠進行體質(zhì)量稱量并記錄，計算各組第30日時總的體質(zhì)量增長率，見圖1，可見E和F組的體質(zhì)量增長率最高，說明在一定的半乳糖濃度閾值下，其體質(zhì)量增長速度與注射半乳糖量的大小有關(guān)，注射劑量越小，大鼠的生長發(fā)育程度越好；C、D與G、H組的注射濃度較高，體質(zhì)量增長率低于其余濃度組。以3 d為一時間段計算各組體質(zhì)量增長率，見表1，可以看出C～H組的體質(zhì)量均在3～6 d這個時間段增長速度最快，A組在15～18 d，B組在6～9 d體質(zhì)量增長速度最快。

二、各組大鼠晶狀體渾濁指數(shù)

裂隙燈觀察直至30 d時，A、B、C、D、E、F、G、H的白內(nèi)障渾濁情況。按之前提到的標準進行記錄和統(tǒng)計換算，我們把同一只大鼠的左右眼指數(shù)取平均后得到渾濁指數(shù)結(jié)果如圖2所示。各組內(nèi)左右眼渾濁指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>005）。AE組，BF組， CG組， DH組的渾濁指數(shù)，即添加半乳糖水喂養(yǎng)與單純腹腔注射形成的白內(nèi)障組間無明顯差異（P>00018）， 其余各組之間的渾濁指數(shù)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<00018）。指數(shù)增長變化率如表3所示。第30日時， A組處于2b級， B組處于4級， C組處于2a級， D組處于3級， E組處1a級， F組處于2a級， G組處于 1c級， H組處于3級，各組大鼠第30日時白內(nèi)障的渾濁情況見圖3。表2與表3相比可知，白內(nèi)障渾濁加重的時間均出現(xiàn)在體質(zhì)量迅速增長之后。說明隨著半乳糖的刺激，大鼠晶狀體的渾濁指數(shù)也隨體質(zhì)量的增加而增加，體質(zhì)量的增長與渾濁指數(shù)增長秩相關(guān)系數(shù)rs=098（P<005）。我們發(fā)現(xiàn)除E組外，低劑量組（A、C、G）75%于第9日時才出現(xiàn)1a級輕度的早期白內(nèi)障改變，而高劑量組（B、D、H）75%基本是在第3日就出現(xiàn)1a級改變，F(xiàn)組25%于第9日開始出現(xiàn)1a級改變，且渾濁程度發(fā)展較低劑量組更為迅速。其余統(tǒng)計各級出現(xiàn)的時間點見表4。

討論

WHO組織在1999年提出的“視覺2020”行動，旨在2020年前根治全球可避免盲，防治中首先提到的即是白內(nèi)障盲，響應(yīng)“視覺2020”，降低視力損害的患病率，讓更多的人避免致盲或復(fù)明是醫(yī)學(xué)事業(yè)的目標之一[8]。有臨床觀察表明，糖尿病患者較非糖尿病患者發(fā)生白內(nèi)障的風(fēng)險較高，且時間較早。目前，滲透壓改變學(xué)說引起糖尿病患者晶狀體發(fā)生渾濁得到了眾多學(xué)者的認可[9]。當血糖濃度過高，過多的糖經(jīng)多元醇通路代謝轉(zhuǎn)化成山梨醇及果糖，這些物質(zhì)因不易透過晶體囊膜而在晶狀體堆積，使晶狀體內(nèi)滲透壓增高，晶體吸水膨脹，最后引發(fā)白內(nèi)障的形成。

常用糖尿病性白內(nèi)障模型建立方法主要有：靜脈或腹腔注射鏈脲佐菌（STZ）； 飼喂 D半乳糖；腹腔注射 D半乳糖；皮下注射D半乳糖；球后注射D半乳糖。STZ是最早用于研究糖性白內(nèi)障模型的藥物，它易引起較高的死亡率，且因誘導(dǎo)的動物糖尿病白內(nèi)障模型顯示白內(nèi)障的進展較快，并不利于糖尿病性白內(nèi)障的研究。D半乳糖：具有價格合適及穩(wěn)定等優(yōu)點。單純的D半乳糖喂養(yǎng)的價格昂貴，最重要的是不能保證每只老鼠攝取的劑量相當，我們認為此種方法易造成較大的實驗誤差。皮下注射、球后注射均可成功誘發(fā)白內(nèi)障[1011]。但是我們認為，等同于腹腔注射的高劑量皮下注射，皮下注射吸收較腹腔慢，考慮到大鼠的耐受能力，我們沒有采用該種方法。球后注射的操作復(fù)雜，可能還會同時引起其他的眼部并發(fā)癥，且球后注射對眼球本身就是一種外傷刺激，我們認為，該種造模方法無法評估球后注射對誘發(fā)白內(nèi)障的影響程度。腹腔注射方法簡易可行，因此曾經(jīng)成為國內(nèi)眼科學(xué)者廣泛使用的方法。在我們嚴格按照每只大鼠的體質(zhì)量進行對應(yīng)劑量的注射的情況下，我們本次研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖腹腔注射的方法是準確可行的，并不是國外大部分學(xué)者認為的不能形成白內(nèi)障，而死亡率也沒有余琛琳等[4]報道的50%那么高。而有些學(xué)者提到不用腹腔注射，用喂養(yǎng)法，因為大多數(shù)老鼠病情惡劣甚至死亡，并且模型非常不穩(wěn)定[12]。實驗過程中，我們確實觀察到大鼠會出現(xiàn)多食、多飲、毛發(fā)粗糙無光澤、聳背等狀態(tài)，但一般精神狀態(tài)及活力良好。有資料表明，選日齡較小的大鼠造模較好，模型復(fù)制的成敗主要取決于大鼠的日齡，而與體質(zhì)量無關(guān)。我們在前期實驗發(fā)現(xiàn)，對基礎(chǔ)月齡為3個月的大鼠進行腹腔注射，觀察至30 d時，未出現(xiàn)任何晶狀體的改變[13]。故此，我們選用了3周左右的大鼠作為建模對象。以往的文獻對半乳糖注射的劑量不確定，也沒有一個確切的標準，甚至有同一學(xué)者同年發(fā)表的兩篇研究相同藥物對白內(nèi)障影響的文章中，所用的半乳糖劑量也不同，在文獻[14]中所用到的劑量為10 g/（kg·d），腹腔注射，而在文獻[15]中所用到的劑量為15 g/（kg·d），腹腔注射。而觀察到的結(jié)果幾乎相同。我們按文獻[16]中提到的方法，將等量的半乳糖溶于4 ml注射用生理鹽水并進行腹腔注射，然而我們預(yù)實驗中第一天按此方法造模的死亡率高達90%。給予的注射半乳糖劑量大小對半乳糖性白內(nèi)障的形成也有明顯影響，據(jù)此，我們選用10 g/kg和15 g/kg劑量來制造動物模型。與陳曉光等[17]和李婧等[18]研究相同，前期我們發(fā)現(xiàn)30%濃度的半乳糖大鼠飲用后容易拒飲并脫水死亡，我們選用了10%的半乳糖飲用水作為輔助藥物，在驗證飼養(yǎng)是否有助于白內(nèi)障形成的同時降低了成本。

這些學(xué)者在研究白內(nèi)障模型時都未提及死亡率的問題，我們本次研究不僅有效的證明了腹腔注射半乳糖可以成功的建立白內(nèi)障動物模型，也發(fā)現(xiàn)了降低動物死亡率的方法[1819]。本次實驗死亡率僅為2083%，造模成功率為7083%，是較穩(wěn)定的半乳糖白內(nèi)障動物模型。

通過多組濃度的實驗，可以看出在一定閾值范圍內(nèi)，注射半乳糖的劑量越大、濃度越高，大鼠的體質(zhì)量增長越快。結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)晶狀體開始出現(xiàn)渾濁的時間隨著體質(zhì)量增長最高峰的出現(xiàn)而出現(xiàn)。我們可以看出除E組外，其余組均是從第3～9日開始出現(xiàn)白內(nèi)障的渾濁。以往的文獻也表明，半乳糖注射產(chǎn)生赤道部水泡的時間大部分在3～5 d，而我們觀察到體質(zhì)量增長速度最快的階段大部分在第3日，說明體質(zhì)量增長和白內(nèi)障的渾濁指數(shù)增長存在一定關(guān)系[20]。高濃度組渾濁指數(shù)：B>H>D，說明在高劑量半乳糖的作用下，加喝半乳糖飲用水對白內(nèi)障的產(chǎn)生沒有正向作用。B組每日1次高濃度效果最佳。低濃度組渾濁指數(shù)：A>C>G，同樣說明了越高濃度的腹腔注射及半乳糖的飲用喂養(yǎng)，對大鼠本身是一種損傷刺激，A組每日1次低濃度形成白內(nèi)障的效果佳。在D組和H組注射劑量相同，且D組加喝半乳糖飲用水的情況下，H組的渾濁指數(shù)大于D組。說明在高劑量半乳糖的作用下，加喝半乳糖飲用水對白內(nèi)障的產(chǎn)生沒有正向作用。C組和G組在注射劑量相同的情況下，渾濁指數(shù)在9～15 d出現(xiàn)平臺期，且G組的平臺期更長，隨后才出現(xiàn)較大幅度的增長，可以看出C組在第10日加喝半乳糖飲用水，相比于G組產(chǎn)生白內(nèi)障的效果更佳。

但是，B組和F組，很明顯地看出喝半乳糖與不喝半乳糖的差別。B、H、D、A組增長幅度最大。F、G組幾乎重疊在一起，說明每日1次高濃度與每日2次低濃度效果相當，甚至每日1次高濃度（F組）造模的效果略好一些。我們的A～D組選擇了國外大部分學(xué)者的方法，添加半乳糖飲食，但是在腹腔注射了一定量的基礎(chǔ)上，輔助添加半乳糖飲用水，用于判斷半乳糖喂養(yǎng)與單純腹腔注射兩種方式之間是否有抵消或促進白內(nèi)障發(fā)展的相互作用。

考慮到大鼠對水合氯醛及戊巴比妥等藥物的耐受窗口較窄，我們的實驗注射劑量已經(jīng)很大，如果再對大鼠進行麻醉或鎮(zhèn)靜容易誘導(dǎo)它們死亡，加之大鼠本身性情較溫順，所以我們采取直接抓取固定有活力的大鼠進行裂隙燈拍照觀察及記錄，避免了因麻醉導(dǎo)致的死亡，極大地降低了死亡率。但是本次研究還存在一些不足，由于這次研究的目的主要是觀察腹腔注射半乳糖是否能成功誘發(fā)白內(nèi)障形成，故我們當時的目的只局限于是否能成功誘發(fā)白內(nèi)障，疏忽了對血糖的監(jiān)測，在以后進一步的實驗研究中，我們會進一步完善我們的實驗方案。另外，由于我們本次的實驗由2名助手輪流進行腹腔注射給藥，A為有經(jīng)驗者，B為初學(xué)者，大鼠死亡的發(fā)生基本在B者注射給藥時，此種給藥途徑，特別是高劑量已經(jīng)基本等量于大鼠的腹腔容積，故我們認為，腹腔注射的方式和方法尤為重要，應(yīng)避免注射時扎到腹腔臟器。但是，在有這個實驗干擾因素的影響下，我們此次的研究較其他學(xué)者的研究降低了死亡率的基礎(chǔ)上，還保證了較高的造模成功率，于是我們認為，我們的方法可以為日后需要對不同時期白內(nèi)障進行實驗研究的學(xué)者提供一個參考方案。

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（收稿日期：20180108）

（本文編輯：楊江瑜）