楊艷麗 楊勇 李大紅 李鴻雁

摘要：為探索桃（Prun，us persica L.）銅/鋅超氧化物歧化酶基因（PpCuZnSOD）在植物抗干旱脅迫中的作用，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將PpCuZnSOD基因轉(zhuǎn)入大豆品種中黃13中。Southern印跡分析證實PpCuZnSOD基因已整合到大豆基因組中。定量PCR分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆中PpCuZnSOD表達(dá)水平均明顯增加。用150/0 PEG4OOO模擬干旱脅迫時，轉(zhuǎn)基因大豆種子萌發(fā)率與主根長顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆。在干旱10 d條件下，轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆相比，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性增加，而丙二醛（MDA）含量下降，葉綠素含量降低較少?；钚匝酰≧OS）染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下活性氧少于非轉(zhuǎn)基因植株。復(fù)水后4d，轉(zhuǎn)基因大豆的成活率顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆。這些結(jié)果表明，PpCuZnSOD能提高大豆的耐旱性。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因;耐旱性;大豆;Pp CuZn，SOD基因

中圖分類號：S565.103.53

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2018）05-0978-06

寒冷、干旱、澇害等環(huán)境脅迫可產(chǎn)生有毒自由基，危害農(nóng)作物生產(chǎn)?；钚匝酰≧OS）對細(xì)胞具有潛在的毒性，通過氧化脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)而破壞正常的新陳代謝。一些研究結(jié)果表明，ROS少量存在時，可以作為重要的信號分子發(fā)揮作用，參與控制病原體防御、激素信號傳導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)和植物生長發(fā)育等過程。然而，當(dāng)活性氧產(chǎn)生量增加時，它們能夠損傷甚至殺死植物細(xì)胞。但是，植物已經(jīng)進(jìn)化出一些防御機(jī)制來減輕不利環(huán)境條件造成的損害。例如，一些ROS清除酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化還原酶（PRXR），可以清除超氧陰離子（02-）等氧化物，從而保護(hù)植物免受環(huán)境脅迫。

超氧化物歧化酶（SOD）是參與ROS降解的第一個酶，能把超氧陰離子轉(zhuǎn)換成H202。SOD有幾種異構(gòu)體，異構(gòu)體類別取決于活性位點上的金屬輔因子，例如，錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、銅/鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、鐵超氧化物歧化酶（FeSOD）和鎳超氧化物歧化酶（NiSOD）等。CuZnSOD是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體膜間隙中的主要自由基清除劑。在脅迫狀態(tài)下，SOD活性和其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平增高。有研究結(jié)果表明，在干旱和鹽脅迫下玉米和番茄中MnSOD和CuZnSOD高水平表達(dá)，這些有較高活性抗氧化酶的植物更耐鹽、干旱或氧化脅迫，高鹽和干旱脅迫能夠改變抗氧化酶水平，在很大程度上提高幼苗的抗逆性。逆境條件下，水稻鹽敏感品種SOD水平顯著高于耐鹽品種。過表達(dá)水稻葉綠體OsCu/ZnSOD基因的轉(zhuǎn)基因株系在NaCl和NaHCO，脅迫下發(fā)芽率顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系。也有研究結(jié)果表明在煙草葉綠體中增強(qiáng)鋅超氧化物歧化酶的表達(dá)后葉綠體對甲基紫精銅（MV）的耐受性也增強(qiáng)。在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和擬南芥上也有相似的現(xiàn)象。因而，鹽脅迫和干旱脅迫下植物SOD活性的增加是緩解逆境損傷的一個步驟。

大豆是一種重要的農(nóng)業(yè)作物，為人類主要植物蛋白質(zhì)來源和植物油來源。在環(huán)境脅迫下，大豆往往在其細(xì)胞中積累活性氧，影響其生長發(fā)育和產(chǎn)量。Guttikonda等把擬南芥DREBID轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)人大豆中，在缺水時，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株能保持較高的相對含水量，而且存活率顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。此外，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因植株還保持了17%～24%的葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性，說明耐旱性增強(qiáng)。李大紅等將苜蓿（Medicago sativa）DREB1基因?qū)舜蠖?，獲得rd29A和CaMV-35S 2類啟動子驅(qū)動的Ms DREB1轉(zhuǎn)基因大豆，在嚴(yán)重干旱脅迫下，這2種啟動子轉(zhuǎn)基因株系均有一定耐旱能力。秦迪等發(fā)現(xiàn)在干旱條件下，8個轉(zhuǎn)菠菜BADH基因大豆株系葉片中BADH基因表達(dá)量較高，轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)芽指數(shù)高于非轉(zhuǎn)基因大豆，在8個轉(zhuǎn)基因大豆材料中有7個增產(chǎn)。魏崍等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過表達(dá)AtCBF4基因和過表達(dá)Bo WS基因的大豆株系，這2個株系均有很強(qiáng)的耐旱性。本研究將桃PpCuZn，SOD基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)人大豆基因組中，在干旱脅迫條件下檢測轉(zhuǎn)基因大豆苗期的耐旱性及其相關(guān)生理指標(biāo)，以期獲得具有一定應(yīng)用價值的耐旱大豆新種質(zhì)，為篩選具有育種應(yīng)用價值的材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株

大豆品種中黃13號由駐馬店農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。大腸桿菌DH5a和根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株均由本實驗室保存。

1.2 質(zhì)粒載體和試劑

克隆載體pMD-18和DNA聚合酶購自于TaKa-Ra（中國大連）有限公司，pCAMBIA1301為本實驗保存。TRIzol試劑購自Sigma公司，其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 根據(jù)GenBank中桃基因序列（XP-021817567）設(shè)計引物Pl（5-CG-GATCCATGGTGAAAGGCGTTGCTGTTC-3'） 和 P2（5'- CGAGCTCTCAGTTTTGGAGACCAATAATA-3'），T劃線為相應(yīng)酶切位點。用TRIzol試劑提取RNA，按說明書方法逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈及雙鏈DNA。PCR反應(yīng)體系（25μl）為：12μl ddH20，lμI模板，10μlEx Taq Mix，上、下游引物各lμl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min：95℃變性60s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增所得片段連接到T載體上。送上海生工公司測序后，與GenBank序列進(jìn)行同源性比對。將載有目的基因PpCuZnSOD序列的T載體和表達(dá)載體pCAMBIA1301分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、SacI雙酶切（圖1），1.2%瓊脂糖電泳檢測酶切結(jié)果。使用DNA回收試劑盒回收目的基因片段和表達(dá)載體片段.1.2%瓊脂糖電泳檢測回收效果，將目的基因片段50ng與載體17 ng加入到緩沖液中，加入T4連接酶lμl（10ng/μl），4℃過夜連接。轉(zhuǎn)化后用PCR與雙酶切檢測質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。用凍融法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因大豆株系的獲得 大豆轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法。用50μg/ml潮霉素篩選抗性轉(zhuǎn)基因植株?？剐赞D(zhuǎn)基因大豆植株經(jīng)練苗后進(jìn)行盆栽。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因大豆Southem blot檢測參照Murraym等的CTAB法提取大豆基因組DNA。PpCuZn，SOD基因PCR分析：引物為P3（5-GAATCATCAACT-TCACCCAG-3'）、 P4 （5-CCAATAATACCACAAG-CAAC-3'），模板為大豆基因組DNA，復(fù)性溫度為55℃，反應(yīng)條件同方法1.3.1。用EcoR I內(nèi)切酶在37℃下酶解大豆基因組DNA。以地高辛隨機(jī)標(biāo)記的PpCuZnSOD基因全長作為探針進(jìn)行Southem雜交檢測，具體方法參照德國羅氏地高辛說明書（DIG DNALabeling and Detection Kit，Roche）進(jìn)行。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因植株mRNA RT-qPCR檢測 對陽性植株的PpCuZn，SOD基因表達(dá)量進(jìn)行分析。用TR-Izol試劑提取轉(zhuǎn)基因大豆葉片RNA.用紫外分光度計測定260 nm吸光度與280 nm吸光度比值，計算RNA濃度。參照SMART cDNA synthesis Kit說明書合成cDNA第一鏈。在ABI 7500實時檢測系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR檢測，試劑為Power Sybr Green PCR試劑（ABI）。熒光定量PCR引物為P5（5- GAAT-CATCAACTTCACCCAGGA-3'）和P6 （5-CCAATA-ATACCACAAGCAACCC-3'）。Actin，基因作為內(nèi)參，上游引物為5'-TGATGGTGTGAGTCACACTGTACC-3，下游引物為5-GGACAATGGATGGGCCAGACTC-3。反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)。所有PCR進(jìn)行3個重復(fù)，并用同一個條件進(jìn)行測試。采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：50℃下2min，95℃下預(yù)變性10min;95℃下15s，60℃下45s，循環(huán)40次?；蚩截悢?shù)的定量采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因大豆耐旱性分析 將檢驗正確的轉(zhuǎn)基因和野生型（對照）大豆種子進(jìn)行萌發(fā)試驗，分別將轉(zhuǎn)基因大豆與對照用15% PEG4000處理，7d后，記錄主根長及種子萌發(fā)率。另外對轉(zhuǎn)基因與對照大豆進(jìn)行缺水試驗。將發(fā)芽20 d的轉(zhuǎn)基因與對照大豆苗移到含有砂與土（質(zhì)量比1：1）基質(zhì)中栽培7d。然后進(jìn)行缺水脅迫處理，10 d后，測定其在干旱脅迫下相關(guān)生理指標(biāo)變化。SOD活性測定采用NBT（四唑氮藍(lán)）還原法，葉綠素含量測定采用分光光度法，POD活性測定采用比色法.MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，CAT活性測定采用紫外吸收法，具體方法均參照文獻(xiàn)。02和H，O，檢測分別用NBT和DAB（3，3-二氨基聯(lián)苯胺）進(jìn)行染色，參照Yan等方法進(jìn)行。然后復(fù)水4d，計算其存活率。每組每個株系6株。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)分析使用Excel 2013及SPSS17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

通過子葉節(jié)轉(zhuǎn)化再生途徑獲得6個大豆轉(zhuǎn)基因株系。用特異引物對再生苗進(jìn)行PCR檢測，均為陽性植株。為了進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植株，對這6個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern blot檢測。以PpCuZnSOD基因的全長作為探針，對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southem雜交驗證，結(jié)果顯示6個轉(zhuǎn)基因株系均有1個拷貝的PpCuZnSOD基因整合到大豆基因組中（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)基因大豆株系PpCuZnSOD表達(dá)量分析

為了檢測目的基因的表達(dá)效果，對6個轉(zhuǎn)基因株系PCR及Southem blot陽性苗進(jìn)行qRT-PCR檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)PpCuZnSOD株系目的基因均能表達(dá)，但基因表達(dá)量存在較大差異。其中L2、L5株系PpCuZnSOD為過表達(dá)，其他株系表達(dá)較弱，而野生型植株基本沒有表達(dá)。由此可見，PpCuZnSOD基因已經(jīng)轉(zhuǎn)到大豆基因組中，且有2個株系表達(dá)量較高（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)基因大豆耐旱性分析

對經(jīng)過檢測的轉(zhuǎn)基因大豆及對照種子用15%PEG4000進(jìn)行模擬干旱處理。7d后，轉(zhuǎn)基因大豆種子的萌發(fā)率和主根長都顯著高于對照（圖4）。對盆栽27 d轉(zhuǎn)基因植株與對照進(jìn)行缺水脅迫處理10d，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因大豆長勢明顯好于對照，葉綠素含量顯著高于對照：復(fù)水后，轉(zhuǎn)基因植株的成活率顯著高于對照（圖4、圖5）。

為了比較大豆轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的耐旱性，將27日齡的盆栽轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱脅迫處理，處理10 d后測定轉(zhuǎn)基因大豆各株系SOD、POD和CAT活性及丙二醛含量。結(jié)果（圖6）表明，各株系與對照差異顯著。干旱脅迫條件下，PpCuZnSOD的過表達(dá)植株MDA含量顯著低于對照，而POD、SOD及CAT活性顯著高于對照。說明PpCuZnSOD過表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株耐旱性提高。

為了進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)基因大豆的耐旱性，對轉(zhuǎn)基因大豆與對照的ROS進(jìn)行檢測，分別用NBT和DAB進(jìn)行染色。結(jié)果（圖7）顯示，干旱脅迫后，過表達(dá)大豆植株葉片顏色明顯淺于對照植株，表明過表達(dá)植株中02和H202的積累明顯低于對照植株。說明干旱脅迫下過表達(dá)Pp CuZn，SOD基因可增強(qiáng)大豆細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力，使02和H202的積累減少，從而減少細(xì)胞受損或細(xì)胞死亡，增強(qiáng)植物的耐旱性。

3 討論

干旱是世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)問題。干旱嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。通過常規(guī)育種方法也能增加大豆的耐旱性，但費力費時，而且遺傳多樣性限制了改進(jìn)的潛力。分子生物學(xué)方法有助于提高作物的耐旱性。許多研究結(jié)果表明，導(dǎo)人外源基因能增加植物的耐旱性。Kudo等發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)OSPIL1和DREBIA的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出較高的耐旱性。Hui等將CuZnSOD和APX基因轉(zhuǎn)入甘薯，提高了甘薯的耐鹽性。本研究將PpCuZnSOD基因轉(zhuǎn)入大豆品種中黃13中，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株根系主根長度明顯大于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，耐旱性增?qiáng)。

植物在干旱脅迫下能產(chǎn)生活性氧（ROS），危害植物生長發(fā)育。SOD通過催化O2歧化反應(yīng)，將其還原為H202，然后，APX將過氧化氫氧化為水和氧。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆中SOD和APX活性均較高。表明轉(zhuǎn)基因植株清除ROS的能力顯著高于對照。轉(zhuǎn)基因植物具有較強(qiáng)耐旱表型，例如在干旱脅迫下具有較低的葉綠素?fù)p失和脂質(zhì)過氧化。轉(zhuǎn)基因植株中CAT、SOD和POD活性的升高降低了干旱脅迫引起的ROS毒性。此外，DAB、NBT染色結(jié)果也表明轉(zhuǎn)PpCuZnSOD基因大豆過氧化氫和超氧陰離子少于非轉(zhuǎn)基因植株。

SOD在植物對不同類型脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。PpCuZnSOD是一種明顯響應(yīng)干旱脅迫的SOD，異源過表達(dá)可以增強(qiáng)大豆的耐旱性，表明PpCuZnSOD基因在植物響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著一定作用，這對以后定向培育抗旱優(yōu)良品種具有參考價值。