高效液相色譜法與酶聯(lián)免疫法檢測小麥中嘔吐毒素含量的比較研究

高艷 陶維春 王睿 沈躍麗

摘? ?要：高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法是常見的嘔吐毒素檢測方法，以小麥為樣品，依次利用高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等對小麥嘔吐毒素進行了分析。對兩者嘔吐毒素檢測結果進行了對比分析，最終結果表明：高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法在小麥嘔吐毒素檢測環(huán)節(jié)，在250～1 450 μg/kg之間存在相關性，且高效液相色譜法測定的小麥嘔吐毒素含量小于酶聯(lián)免疫法測定的結果。

關鍵詞：高效液相色譜法;酶聯(lián)免疫法;小麥;嘔吐毒素;含量

嘔吐毒素又稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，其為鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉毒素。依據(jù)糧食衛(wèi)生標準的相關規(guī)定，小麥嘔吐毒素限量標準為1 000.0 μg/kg。嘔吐毒素對于糧食谷物的污染狀況與產(chǎn)毒菌株、溫度、濕度、通風、日照等因素有關。而現(xiàn)階段我國部分地區(qū)小麥嘔吐毒素含量出現(xiàn)嚴重超標現(xiàn)象，特別是在多雨的年份，因此強化嘔吐毒素檢測管理非常重要?，F(xiàn)階段在小麥嘔吐毒素檢測過程中，高效液相色譜及酶聯(lián)免疫為常用的方法，通過對兩者檢測結果的相關性分析，可有效判斷小麥嘔吐毒素的有效檢測[1～3]。

1? ?高效液相色譜法材料及方法

1.1? ?試劑、材料

甲醇（色譜純）、聚乙二醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱、玻璃纖維濾紙（直徑11 cm、孔徑1.5 μm）。

1.2? ?主要儀器

色譜儀（配有紫外檢測器）、天平（感量0.001 g）、高速萬能粉碎機、空氣壓力泵、試驗篩（1 mm孔徑）、均質(zhì)器（轉速大于10 000 rpm/min）、注射器（10 mL）。

1.3? ?方法

1.3.1? ?標準溶液的配制

將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標準溶液100 μg/mL用甲醇水（20∶80）分別稀釋成0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL標準工作液。

1.3.2? ?樣品前處理

（1）將樣品研磨，硬質(zhì)的糧食用高速萬能粉碎機磨細并通過試驗篩（1.2 mm孔徑），不要磨成粉末，稱取25 g（精確到0.01 g）磨碎的試樣于100 mL容量瓶中加入5 g聚乙二醇，用水定容至刻度，混勻，轉移至均質(zhì)杯中，高速攪拌2 min。定量濾紙過濾后以玻璃纖維過濾至濾液澄清，收集濾液于干凈的容器中。

（2）凈化。將2 mL濾液以1滴/2 s的速度緩慢通過免疫親和柱;用20 mL水沖洗柱子，流速1滴/s，棄去流出液，加入1.0 mL甲醇（色譜級）洗脫，流速自然重力，直至2～3 mL空氣通過柱體，收集全部洗脫液。

（3）高效液相色譜參考條件。色譜柱：C18柱，5 μm，150 mm×4.6 mm;流動相：甲醇+水（20+80）;流速：0.8 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：50 μL;檢測波長：218 nm。

根據(jù)整體樣品峰保留時間進行定性分析，隨后依據(jù)相應峰面積利用外標法進行定量評估。

2? ?酶聯(lián)免疫法材料及方法

酶聯(lián)免疫法在實際應用中主要是利用酶聯(lián)免疫盒進行間接酶聯(lián)免疫檢測。

2.1? ?材料、試劑

嘔吐毒素檢測試劑盒、去離子水。

2.2? ?主要儀器

酶標儀：450 nm;恒溫培養(yǎng)箱：37 ℃;天平：感量0.001 g;粉碎機;離心機;微量移液器。

2.3? ?方法

2.3.1? ?樣品前處理

將5 g粉碎好的樣品加入25 mL去離子水，離心機5 000 rpm離心5 min，取上清液500 μL備用。

2.3.2? ?試劑盒檢測

本試驗使用蘇微牌DON檢測試劑盒。

取出試劑盒中所有試劑和微孔板回溫（20～25 ℃）30 min以上;將標準品孔、樣品孔進行編號，以便記錄位置;每孔加入250 μL洗滌液，放置40 s，甩掉拍干，重復一次;將標準溶液、樣品液各50 μL加入標記孔中，分別加入酶標物50 μL/孔、抗試劑50 μL/孔，培養(yǎng)箱37 ℃反應30 min;甩掉反應液，用洗滌液250 μL/孔充分洗滌5次，每次間隔30 s，拍干;依次分別加入底物液50 μL/孔、顯色液50 μL/孔，培養(yǎng)箱37 ℃反應15 min;之后加入終止液50 μL/孔，酶標儀450 nm，讀取每孔的吸光度OD值。

3? ?結果及討論

3.1? ?結果

經(jīng)過小麥樣品加標回收試驗后，重復反應3次，并在樣品提取后分別使用高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法進行小麥提取物嘔吐毒素的檢測。其中高效液相色譜法在樣品處理前期需經(jīng)過免疫親和柱，而酶聯(lián)免疫法可直接反應。在本次反應過程中，將高效液相色譜法過柱后的樣品又進行了酶聯(lián)免疫試驗，最終所得結果見表1。

3.2? ?分析

通過表1數(shù)據(jù)可得出，使用高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法分別對小麥提取物進行檢測，所測得的小麥嘔吐毒素含量高效液相色譜法小于酶聯(lián)免疫法，且當嘔吐毒素含量大于100 μg/g時，兩者之間的測量平均差值在425 ng/g以上，而在嘔吐毒素含量在100 ng/g以下時，兩者測量數(shù)值差值在105 ng/g以下。使用高效液相色譜法對于嘔吐毒素的檢測限度為100 ng/g。通過對整體測量數(shù)值的綜合評估，可得出兩者偏差影響因素。首先在高效液相色譜法的甲醇洗脫過程主要采用固相萃取的措施，而在實際洗脫過程中由于洗脫時間及洗脫頻率沒有得到有效控制，從而導致整體檢出率偏低;其次在酶聯(lián)免疫檢測過程中樣品稀釋倍數(shù)與高效液相色譜法稀釋倍數(shù)存在差異性，從而導致整體酶聯(lián)免疫檢測結果出現(xiàn)假陽性反應;再加上經(jīng)過免疫親和柱后樣品可由免疫親和柱吸收一部分，從而導致免疫親和柱過濾后的樣品酶聯(lián)免疫法所得結果與高效液相色譜法最終差異不大。而且隨著樣品添加量的增加，其兩者的重復性呈現(xiàn)良好的態(tài)勢，這種情況表明酶聯(lián)免疫法試劑盒檢測結果具有一定穩(wěn)定性。

通過直接過濾酶聯(lián)免疫法檢測結果分析，可得出在添加物濃度在100 ng/g時整體回收率為164.3%，而隨著添加物濃度的增加，酶聯(lián)免疫法檢測結果回收率出現(xiàn)下降趨勢。這種情況主要是由于添加物濃度過低會導致內(nèi)在樣品雜質(zhì)干擾程度增加，從而出現(xiàn)假陽性反應。而直接過濾酶聯(lián)免疫檢測法與經(jīng)過免疫親和柱之后的酶聯(lián)免疫反應回收率存在差異，則主要是由于樣品提取液流經(jīng)免疫親和柱的濃度損失。這就導致在實際檢測過程中，利用免疫親和柱高效液相色譜法進行小麥嘔吐毒素測定時，具有親和柱洗脫樣品不完全的風險，再加上高效液相色譜法在實際應用中需要對小麥樣品液進行過柱、淋洗、定容等措施，整體檢測時效不高，且耗費成本較大，因此其在實際應用中常用于在酶聯(lián)免疫法出現(xiàn)假陽性反應之后的確認工作。

4? ?總結

總而言之，酶聯(lián)免疫法在實際檢測過程中主要以抗原抗體特異性反應為依據(jù)，具有良好的檢測靈敏度及特異性。而且相較于高效液相色譜法而言，酶聯(lián)免疫法并不需要進行樣品前處理及免疫親和柱過柱等過程，從而有效地提高了樣品檢測效率。而高效液相色譜法主要是利用樣品純化，依據(jù)免疫親和柱過程中抗原與特異性抗體的結果理論，可以有效避免樣品檢測假陽性反應，具有檢測結果準確度較高的優(yōu)良特點。在實際應用中可根據(jù)具體檢測需要，選擇適宜的檢測方法。

參考文獻：

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