抗菌肽對(duì)煙草青枯菌的抑菌作用

江仕龍 劉明宏 高亞星 蔣選利

摘?要：煙草青枯病是煙草生產(chǎn)上的主要病害之一，安全、有效的防治煙草青枯病對(duì)煙草生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為了解決煙草青枯病的防治這一難題，設(shè)計(jì)了5種人工合成的多肽和寡肽，采用抑菌圈測(cè)定法測(cè)定其對(duì)青枯菌的抑制效果。結(jié)果表明，編號(hào)為228的寡肽效果最好，有望成為新的青枯病生物防治藥劑。

關(guān)鍵詞：抗菌肽;青枯菌;抑菌作用;生物防治

中圖分類號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2018）06-0092-03?國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.016

煙草青枯病（Tobacco bacterial wilt）是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的危害世界煙草生產(chǎn)的重要病害。此病1880年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，現(xiàn)已成為熱帶和亞熱帶煙區(qū)最常見的病害之一，在我國(guó)長(zhǎng)江以南各煙區(qū)發(fā)生普遍[1]。對(duì)煙草青枯病的防治，主要有選用抗病品種、優(yōu)化栽培管理和藥劑防治這幾個(gè)措施，但是沒有十分理想的防治手段。近年來(lái)，尋找新的防治藥劑的目光落在了抗菌肽（antimicrobial peptide）上面[2]?？咕氖莿?dòng)植物先天性免疫的重要組成部分，是動(dòng)植物防御微生物入侵的一道有效屏障[3]。它們能作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、寄生蟲、癌細(xì)胞甚至是薄膜病毒，而絕大多數(shù)抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物的正常細(xì)胞是無(wú)害的，并且殺菌機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素完全不同[4]。

本文在天蠶抗菌肽（Cecropin）的基礎(chǔ)上，通過修飾天蠶抗菌肽肽序，設(shè)計(jì)了5種多肽，采用抑菌圈測(cè)定法研究其對(duì)煙草青枯菌的抑菌作用。

1?材料與方法

1.1?材料

所用的五種多肽由上海淘普生物科技有限公司合成（見表1）。煙草青枯病菌（R.solanacearum）由作者自己分離、純化獲得。

1.2?方法

于固體NA培養(yǎng)基上活化保存的青枯菌24 h（28℃），然后用接種環(huán)刮取活化的青枯菌到裝有約125 mL液體NA培養(yǎng)基的錐形瓶，并將錐形瓶置于28℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 取少許培養(yǎng)液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在490 nm處的吸光度，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)得的OD值為1.70±0.05則可以直接用于下一步，如超過，則用無(wú)菌水稀釋培養(yǎng)液到該吸光度（此吸光度青枯菌濃度為106～107 cfu/mL，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）。然后用移液槍取100 uL培養(yǎng)液到有固體NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，并用玻璃細(xì)菌涂布棒涂抹均勻待用。

稱取適量人工合成的凍干肽粉于2 mL規(guī)格無(wú)菌離心管中，并加無(wú)菌水稀釋配成母液，再以母液加無(wú)菌水稀釋到其他濃度，最后得到500 μg/mL、250 μg/mL和125 μg/mL三個(gè)濃度，分別用A、B、C表示。然后取適量滅菌濾紙片于裝有肽溶液和無(wú)菌水的離心管中浸泡，將浸泡后的濾紙片用鑷子夾出，放置于涂有細(xì)菌培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿放同一處理的三個(gè)濾紙片，大致呈等邊三角形，每個(gè)處理用兩個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)做三個(gè)抑菌點(diǎn)測(cè)試，即相當(dāng)于6個(gè)重復(fù)。最后將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng);于48 h后測(cè)量抑菌圈大小，記錄并拍照。

2?結(jié)果與分析

本次實(shí)驗(yàn)中使用的多肽，對(duì)煙草青枯病菌均有一定的抑制作用。其抑制作用的大小，與多肽的濃度有關(guān)，高濃度的時(shí)候抑菌圈最大，即抑菌活性最強(qiáng)，低濃度的時(shí)候抑菌圈小，即抑菌活性最弱。不同的多肽，其抑制作用不同，其中抑菌效果最好的是編號(hào)為228的多肽，最差的是編號(hào)為222的多肽。

天蠶抗菌肽是一類具有抗菌活性的肽的總稱，自從Steiner等1881年首次命名了兩種天蠶抗菌肽以來(lái)[5]，在常用的在線抗菌肽據(jù)庫(kù)APD（the Antimicrobial Peptides Database）和CAMPR3（Collection of Anti-Microbial Peptides）中，已經(jīng)各自收錄了37條和185條天蠶抗菌肽序列（含人工合成序列），是抗菌肽研究中的熱門家族。但其對(duì)煙草青枯病菌是否具有抑菌作用，未見報(bào)道。在本試驗(yàn)中，只有11個(gè)氨基酸殘基的寡肽比含有29個(gè)氨基酸殘基的多肽抑菌效果好，和以前報(bào)道的研究結(jié)果相似[6-7]。

3?結(jié)論與討論

在活性較強(qiáng)的4個(gè)寡肽中，雖然氨基酸殘基一樣，序列也高度相似，但是抑菌效果差別較大?？咕牡慕Y(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)至少有7個(gè)因素和肽的生物活性有關(guān)，它們是大小、肽序、結(jié)構(gòu)度、凈電荷、總疏水性、總親水性、螺旋的疏水面和親水面各自的寬度[8]。通過APD的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具，得知所有寡肽的凈電荷都是 +4，但只有編號(hào)為228的寡肽的疏水性基團(tuán)所占比例為54%，其它3種寡肽的疏水性基團(tuán)所占比例均為63%，這可能在一定程度上影響了寡肽的活性。

利用抗菌肽防治煙草青枯病屬于生物防治的一種，當(dāng)前研究得比較多的生物防治方法是利用生防菌來(lái)防治煙草青枯病，即為傳統(tǒng)的生物防治方法。肖田等[9]的研究指出，生防菌防治效果的好壞，除了與生防菌菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有關(guān)，還與該菌株是否能夠在寄主上定殖、該菌株與致病菌位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)能力以及是否能夠誘導(dǎo)寄主抗性等因素有關(guān)。這些因素，加上青枯菌的多樣性和煙草不同的主栽品種，使得利用生防菌這種傳統(tǒng)的生物防治方法的防治效果不穩(wěn)定，或者前期防治效果好后期防治效果差的情況時(shí)有發(fā)生[10]。相比之下，抗菌肽直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜[11-12]，所以受其他因素的影響程度比生防菌小。因此，將篩選到抑菌效果理想的抗菌肽，利用微生物發(fā)酵技術(shù)繁殖這種抗菌肽，用于生產(chǎn)中防治植物病害，是一種全新的生物防治技術(shù)，該方法屬于現(xiàn)代生物防治方法。這種利用抗菌肽的現(xiàn)代生物防治方法在人類疫病防治方面應(yīng)用較多，而在植物病害防治方面非常少。本研究以煙草青枯病為對(duì)象，進(jìn)行了初步的抑制作用研究，僅僅是利用抗菌肽防治植物病害研究的開始，隨后將進(jìn)一步進(jìn)行田間防效試驗(yàn)研究，為控制煙草青枯病提供新的生防技術(shù)。

參?考?文?獻(xiàn)：

[1]?周志成，肖啟明，曾愛平，等.煙草病蟲害及其防治[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：56.

[2]?Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms[J].Nature，2002，415（6870）：389-395.

[3]?司菡.抗菌肽的研究進(jìn)展[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8（4）：393-396.

[4]?徐靈龍，王云峰，石星明，等.抗菌肽及其功能研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2007，27（1）：115-118.

[5]?Stciner H，Hultmark D，Engstrom A，et al.Sequence and specicity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Nature，1981（292）：246-8.

[6]?Andreu D，Ubach J，Boman A， et al.Shortened cecropin A-melittin hybrids Significant size reduction retains potent antibiotic activity[J].FEBS letters，1992，296（2）：190-194.

[7]?Ferre R，Badosa E，F(xiàn)eliu L，et al.Inhibition of plant-pathogenic bacteria by short synthetic cecropin A-melittin hybrid peptides[J].Applied and environmental microbiology，2006，72（5）：3302-3308.

[8]?Tossi A，Sandri L，Giangaspero A.Amphipathic，α-helical antimicrobial peptides[J].Peptide Science，2000，55（1）：4-30.

[9]?肖?田，肖崇剛，鄒?陽(yáng)，等.青枯菌無(wú)致病力菌株對(duì)煙草青枯病的控病作用初步研究[J].植物保護(hù)，2008，34（2）：79-82.

[10]?周崗泉，張建華，陳澤鵬，等.煙草內(nèi)生細(xì)菌及其對(duì)煙草青枯病的生物防治研究[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2008，14（2）：31-34.

[11]?Epand R M，Vogel H J.Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action[J].Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Biomembranes，1999，1462（1）：11-28.

[12]?Shai Y.Mechanism of the binding，insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by α-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides[J].Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Biomembranes，1999，1462（1）：55-70.