CCR5在三陰性乳腺癌組織中的表達及其 對5年生存的影響

胡慧鈺　劉姝妍

〔摘要〕 目的 研究 CCR5在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達以及其對患者生存預后的影響。方法 使用免疫組化方法檢測CCR5在62例三陰性乳腺癌癌組織標本中的表達水平，繪制Kaplan-Meier曲線分析CCR5表達水平對患者生存預后的影響。結果 在62例臨床三陰性乳腺癌癌組織標本中，29例樣本CCR5高表達，占樣本總數(shù)的46.77%；33例樣本CCR5低表達，占樣本總數(shù)的53.22%。5年生存分析：CCR5高表達與三陰性乳腺癌患者5年生存呈負相關（P=0.0031<0.05）。結論 CCR5在中國湖南地區(qū)乳腺癌患者癌組織樣本中均有表達，高表達CCR5提示患者預后較差，高表達CCR5可能促進三陰性乳腺癌進展及轉移。

〔關鍵詞〕 CCR5；CCL5；三陰性乳腺癌；5年生存

〔中圖分類號〕R737.9 〔文獻標志碼〕B 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.018

CCR5 Expression in Triple-Negative Breast Cancer Tissue and Its Impact on 5 Year Survival

HU Huiyu1， LIU Shuyan2， BAN Yi3， LI Xin1*

（1. Department of Breast Surgery， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan 410008， China；

2. Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Hospital of Jilin University， Changchun， Jilin 130000， China；

3. Weill Cornell Medicine， New York 10065， America）

〔Abstract〕 Objective To investigate the CCR5 expression in triple-negative breast cancer （TNBC） tissue， and its impact on survival prognosis. Methods The CCR5 expression in 62 specimens of TNBC were determined by immunochemical staining. Kaplan-Meier estimate was used to analyze the survival prognosis of TNBC patients. Results 29 cases， accounted for 46.77%， showed high expression of CCR5， and 33 cases， accounted for 53.22%， showed low expression of CCR5. High expression of CCR5 was negatively correlated with the 5-year-survival rates of these TNBC patients. Conclusion In the triple negative breast cancer patients in Hunan region of China， CCR5 is expressed. The high level expression of CCR5 indicated bad survival prognosis. CCL5/CCR5 may promote TNBC progression and metastasis.

〔Keywords〕 CCR5； CCL5； triple negative breast caner； 5-year-survival

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC）是被定義為缺乏雌激素受體（estrogen receptor， ER）、孕激素受體（progesterone receptor）以及人表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor type 2，HER2）表達的亞型乳腺癌[1]，在所有乳腺癌病例中大約占15%[2]，具有侵襲性強、易復發(fā)、易轉移、生存期短和病死率高等特點[3-4]。三陰性乳腺癌因為缺乏有效的受體靶標，臨床治療上現(xiàn)在除了傳統(tǒng)的化療藥物外，治療選擇受到極大限制。

趨化因子是生理上控制免疫細胞遷移的小分子量細胞因子，其功能通過與其同源的、屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的膜受體相結合而實現(xiàn)。受體激活激發(fā)了一系列下游信號通路，從而導致細胞遷移。CCL5屬于CC趨化因子家族，其功能通過與其同源受體CCR5相結合而實現(xiàn)。CCL5主要表達于T細胞、血小板、巨噬細胞、管狀上皮細胞、內皮細胞以及某些特定的腫瘤細胞當中[5-6]。一項基于TCGA以及METABRIC大數(shù)據(jù)樣本庫的研究顯示CCL5/CCR5特異性表達于三陰性乳腺癌樣本中[7]。有研究顯示，CCR5在基底樣乳腺癌（主要為三陰性乳腺癌）的侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用[8-10]。

本研究旨在探索CCR5在我國三陰性乳腺癌患者中的表達水平，并分析其生存預后差異，為尋求中國TNBC治療新靶點提供方向。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集2010年10月至2013年3月間于湘雅醫(yī)院乳腺科行外科手術治療的三陰性乳腺癌臨床資料及手術病理樣本共62例。本實驗通過湘雅醫(yī)院倫理委員會批準，倫理號：201308381。病人均簽署知情同意書。

1.2 方法及試劑

使用免疫組化方法檢測手術樣本中CCR5蛋白。脫蠟與染色：福爾馬林固定的三陰性乳腺癌組織白片依次浸泡于二甲苯、100%酒精、95%酒精、70%酒精、50%酒精、PBS液中?？贵w孵化：抗人CCR5抗體源自R&D systems，二抗為HRP-AEC免疫組化檢測試劑盒。最后蘇木精染色：CCR5顯色為紅至紅棕色，蘇木精顯色為藍色。

1.3 結果判斷

CCR5主要表達于癌組織內浸潤的中性粒細胞中，蘇木精染色后呈現(xiàn)出紅至紅棕色。定性分析：每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野（400倍），以細胞質呈清晰紅棕色著色作為陽性表達細胞，記錄陽性細胞所占比例及染色強度。評分標準：按陽性細胞數(shù)比例計0、1、2、3、4分，分別對應無陽性細胞、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%。按陽性細胞著色程度分別記為0、1、2、3、4分，依次對應無著色、淡紅色、紅色、紅棕色。上述兩種計分相加，取2名病理科醫(yī)師平均分值。1～3分判為CCR5低表達，4～8判為CCR5高表達。定量分析：將免疫組化染色切片在顯微鏡高倍鏡視野下定位后，彩色攝像機提取細胞圖像輸入Image-Pro Plus （IPP）圖像處理分析軟件，通過圖像分割，統(tǒng)計，獲得各病理切片細胞CCR5平均吸光光度值（u值）。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用“x±s”表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分率（%）表示，采用？字2檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。生存分析Kaplan-Meier 5年生存曲線使用graphpad prism 6系統(tǒng)繪制完成。

2 結果

2.1 CCR5在三陰性乳腺癌中表達情況

CCR5主要表達于癌組織內浸潤的中性粒細胞中，在所有62例三陰性乳腺癌臨床癌組織樣本中，29例樣本CCR5高表達，占樣本總數(shù)的46.77%；33例樣本CCR5低表達，占樣本總數(shù)的53.23%。CCR5高、低水平表達兩組u值差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002<0.05）。見圖1和表1。

2.2 三陰性乳腺癌患者不同表達水平CCR5與生存預后關系

對62例三陰性乳腺癌患者進行隨訪，隨訪結果顯示CCR5高表達組5年生存率明顯低于CCR5低表達組（P=0.0031<0.05）。見圖2。

3 討論

三陰性乳腺癌具有平均發(fā)病年齡小、組織學分級高、侵襲性強、細胞增值率高、易復發(fā)轉移等特點，化療是三陰性乳腺癌目前唯一有效的全身綜合治療手段。有薈萃分析綜合了全球13份研究數(shù)據(jù)，包含3 087位患者以及3 735名對照成員，研究顯示CCL5及其受體CCR5高表達與乳腺癌易感性明顯相關，而與膀胱癌、宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌以及頭頸部癌癥無明顯關系[11]。一項基于TCGA以及METABRIC大數(shù)據(jù)樣本庫的研究，在比較了Luminal A型、Luminal B型、Her 2陽性型及基底樣型乳腺癌各亞型中CCL5/CCR5表達水平后發(fā)現(xiàn)，CCL5/CCR5特異性表達于三陰性乳腺癌樣本中[7]。

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移與遷徙過程中，腫瘤微環(huán)境一直扮演著重要角色，腫瘤微環(huán)境包含了腫瘤及其周圍細胞、血管、細胞外間質、細胞因子以及細胞趨化因子[12]。CCL5（chemokine C-C motif ligand 5）， 又被稱之為RANTES （regulated upon activation， normal T-cell expressed and secreted），它是一個參與癌癥炎性進程的重要細胞趨化因子。CCL5基因位于人類常染色體17q11.2-q12上，編碼的蛋白質在許多生理過程中扮演重要角色[13]。CCL5介導了免疫細胞的遷移與趨化。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的CCL5主要來源于MSCs[14-15]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的前體細胞，其在軟骨、骨、脂肪、肌肉等組織的再生中起重要作用[16]。研究中當乳腺癌細胞與MSCs在體外共同培養(yǎng)時，MSCs將釋放大量CCL5[17]。而且，缺氧與CCL5可共同刺激乳腺癌細胞分泌CSF1（colony-stimulating factor 1），后者促使MSCs分泌更多的CCL5，從而形成正循環(huán)[18]。在此過程中，CSF1介導了腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrop

hages， TAMs）分泌表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），從而促進乳腺癌細胞的轉移[18]。有實驗構建CCL5過表達的乳腺癌細胞系，并觀察到其細胞運動能力與侵襲性顯著增加，從而使得其在體內經由血管到達身體遠處部位形成轉移灶能力顯著提高，證實了CCL5促進乳腺癌細胞轉移[17]。CCL5還通過促進金屬蛋白酶（metalloproteinases，MMPs）的分泌，破壞細胞外間質蛋白，加速腫瘤細胞的遷移[19-20]。動物模型實驗證實，與原發(fā)灶相比較，轉移灶癌細胞中CCR5表達陽性的乳腺癌細胞比例增加了8倍[21]。

在人三陰性乳腺癌細胞系（MDA-MB-231）中，也證實了CCL5可以促進其增殖潛能[22]。人體實驗表明，血漿CCL5濃度與TGF-β1正相關[23]，而CCL/CCR5復合體正是通過促進T調節(jié)細胞分泌TGF-β來加速抗癌免疫細胞CD8+ T細胞的凋亡，從而加速癌癥進程[24]，可以判斷CCR5陽性的乳腺癌細胞增殖侵襲能力更強。國內鮮有研究報道中國南方三陰性乳腺癌患者中CCR5表達水平及其預后。本研究首次證實中國南方三陰性乳腺癌患者癌組織中CCR5表達水平，并發(fā)現(xiàn)高水平CCR5表達與患者預后呈負性相關。而既往體內外研究也證明了CCL5/CCR5直接促進乳腺癌進展與轉移[21-24]。這項結論也同時可以解釋為何三陰性乳腺癌較其他類型乳腺癌復發(fā)轉移風險更高。

2014年，CCL5-CCR5復合體結構被公諸于世[25]，這為抑制其功能從而降低乳腺癌復發(fā)轉移風險提供了新的方向?，F(xiàn)在國際市場上已有針對于CCR5的單抗藥物Maraviroc應用于抗HIV治療中[26]，并通過美國藥品食品管理局（US food and drug administration， FDA）批準。已有臨床試驗證實了maraviroc可以有效降低乳腺癌患者肺轉移癌的發(fā)生[26]。另有文獻報道，原花青素（procyanidins，PC）對三陰性乳腺癌也有一定抑制作用[27]，這也為中國乳腺癌患者尤其是三陰性乳腺癌患者的治療提供了新的方向。

參考文獻：

[1] FOULKES W D， SMITH I E， REIS-FILHO J S， Triple-negative breast cancer[J]. N Engl J Med， 2010，363（20）：1938-1948.

[2] REIS-FILHO J S. TUTT A N. Triple negative tumours： a critical review[J]. Histopathology， 2008， 52（1）：108-118.

[3] CAREY L， WINERE， VIALE G， et al. Triple-negative breast cancer： disease entity or title of convenience[J]. Nat Rev Clin Oncol， 2010，7（12）：683-692.

[4] MONTAGNA E， BAGNARDI V， ROTMENSZ N， et al. Outcome and Medial Presentation of Breast Cancer： European Institute of Oncology Experience[J]. Clin Breast Cancer， 2015，15（6）： 440-447.

[5] APPAY V， ROWLAND-JONES S L. RANTES： a versatile and controversial chemokine[J]. Trends in Immunology， 2001，22（2）： 83-87.

[6] LEVY J A. The unexpected pleiotropic activities of RANTES[J]. J Immunol， 2009，182（7）：3945-3946.

[7] FERTIG E J， LEE L， PANDEY N B， et al. Analysis of gene expression of secreted factors associated with breast cancer metastases in breast cancer subtypes[J]. Sci Rep， 2015，5：12133.

[8] MANES S， MIRA E， COLOMER R， et al. CCR5 expression influences the progression of human breast cancer in a p53-dependent manner[J]. J Exp Med， 2003，198（9）：1381-1389.

[9] MUROOKA T T， RAHBAR R， FISH E N. CCL5 promotes proliferation of MCF-7 cells through mTOR-dependent mRNA translation[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2009，387（2）：381-386.

[10] VADAY G G， PEEHL D M， KADAM P A， et al. Expression of CCL5 （RANTES） and CCR5 in prostate cancer[J]. Prostate， 2006， 66（2）：124-134.

[11] LEE Y H， BAE S C， SONG G G. Association between the chemokine receptor 5 delta32 polymorphism and rheumatoid arthritis： a meta-analysis[J]. Mod Rheumatol， 2013，23（2）： 304-310.

[12] ALLINEN M， BEROUKHIM R， CAI L， et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer[J]. Cancer Cell， 2004，6（1）： 17-32.

[13] DONLON T A， KRENSKY A M， WALLACE M R， et al. Localization of a human T-cell-specific gene， RANTES （D17S136E）， to chromosome 17q11.2-q12[J]. Genomics， 1990，6（3）： 548-553.

[14] JAYASINGHE M M， GOLDEN J M， NAER P， et al. Tumor-derived CCL5 does not contribute to breast cancer progression[J]. Breast Cancer Res Treat， 2008，111（3）：511-521.

[15] ZHANG Y， LV D， KIM H J， et al. A novel role of hematopoietic CCL5 in promoting triple-negative mammary tumor progression by regulating generation of myeloid-derived suppressor cells[J]. Cell Res， 2013， 23（3）： 394-408.

[16] PITTENGER M F， MACKAY A M， BECK S C， et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science， 1999，

284（5411）：143-147.

[17] KARNOUB A E， DASH A B， VO A P， et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J]. Nature， 2007， 449（7162）： 557-563.

[18] CHATURVEDI P， GILKES D M， TAKANO N， et al. Hypoxia-inducible factor-dependent signaling between triple-negative breast cancer cells and mesenchymal stem cells promotes macrophage recruitment[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2014，111（20）：2120-2129.

[19] SWAMYDAS M， RICCI K， REGO S L， et al. Mesenchymal stem cell-derived CCL-9 and CCL-5 promote mammary tumor cell invasion and the activation of matrix metalloproteinases[J]. Cell Adh Migr， 2013，7（3）： 315-324.

[20] YANG Y， WOLFRAM J， SHEN J， et al. Live-cell single-molecule imaging reveals clathrin and caveolin-1 dependent docking of SMAD4 at the cell membrane[J]. FEBS Lett， 2013，587（24）：3912-3920.

[21] VELASCO-VELAZQUEZ M， PESTELL R G. The CCL5/CCR5 axis promotes metastasis in basal breast cancer[J]. Oncoimmunology， 2013，2（4）：e23660.

[22] LIN S， WAN S， SUN L， et al. Chemokine C-C motif receptor 5 and C-C motif ligand 5 promote cancer cell migration under hypoxia[J]. Cancer Sci， 2012，103（5）： 904-912.

[23] HARTMANN M C， DWYER R M， COSTELLO M， et al. Relationship between CCL5 and transforming growth factor-beta1 （TGFbeta1） in breast cancer[J]. Eur J Cancer， 2011，47（11）： 1669-1675.

[24] CHANG L Y， LIN Y C， MAHALINGAM J， et al. Tumor-derived chemokine CCL5 enhances TGF-beta-mediated killing of CD8（+） T cells in colon cancer by T-regulatory cells[J]. Cancer Res， 2012，72（5）： 1092-1102.

[25] TAMAMIS P， FLOUDAS C A. FLOUDAS C A. Elucidating a key anti-HIV-1 and cancer-associated axis： the structure of CCL5 （Rantes） in complex with CCR5[J]. Sci Rep， 2014，4：5447.

[26] VELASCO-VELAZQUEZ M， JIAO X， FUENTE M， et al. CCR5 antagonist blocks metastasis of basal breast cancer cells[J]. Cancer Res， 2012，72（15）： 3839-3850.

[27] 黃秉一，徐朝軍，宋 嵐.原花青素促進三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的作用機制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（11）：1196-1199.