朱 維，米榮升，王進(jìn)香，王 翠，黃 燕，張燁華，賈海燕，張曉麗，韓先干，陳兆國(guó)

（1.山東省滕州市畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，滕州277599；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海） 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；3.寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，銀川 750011；4.河南省動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，鄭州450008）

隱孢子蟲?。╟ryptosporidiosis）是重要的人獸共患寄生蟲病，該病呈世界性分布，廣泛存在于大洋洲、美洲、亞洲、非洲和歐洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[1]。2004年，世界衛(wèi)生組織將隱孢子蟲病列為被忽視疾病[2]。目前還未有有效的藥物治療該病。

羊各個(gè)年齡均能夠感染隱孢子蟲，但隱孢子蟲主要對(duì)羔羊致病，輕者消瘦、阻礙生長(zhǎng)，重者引發(fā)腹瀉，甚至死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1974年，Baker和 Carbonell首次在澳大利亞綿羊中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染[3]，隨后世界范圍內(nèi)都有報(bào)道。研究表明，羊感染的蟲種主要有3種，包括微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum，C. parvm）、肖氏隱孢子蟲（C. xiaoi）和泛在隱孢子蟲（C. ubiquitum）；其他隱孢子蟲蟲種，如人隱孢子蟲（C. hominis）、安氏隱孢子蟲（C.andersoni）、豬隱孢子蟲（C. suis）、母豬隱孢子蟲（C. scrofarum）、費(fèi)氏隱孢子蟲（C. fayeri）和隱孢子蟲綿羊基因型也見報(bào)道，這些蟲種多數(shù)是人獸共患的隱孢子蟲[4]。

山東省是我國(guó)養(yǎng)殖大省，2015年羊的存欄量為2235.66萬頭，僅次于內(nèi)蒙古自治區(qū)和新疆維吾爾自治區(qū)。目前，關(guān)于山東省羊隱孢子蟲感染情況鮮有報(bào)道。2013年，李夢(mèng)婕等[5]對(duì)山東東營(yíng)地區(qū)綿羊樣品的檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染；2014年，Mi等[6]對(duì)山東滕州地區(qū)100份山羊樣品進(jìn)行了檢測(cè)，感染率為18.00%，僅發(fā)現(xiàn)C. xiaoi感染，未對(duì)該地區(qū)綿羊隱孢子蟲進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，山東滕州地區(qū)2015年羊的存欄量為40.9萬頭[7]，然而羊感染隱孢子蟲的分子特性目前并不清楚。因此，為了初步弄清滕州市羊感染隱孢子蟲的分子特性，本研究選取了該市2個(gè)綿羊養(yǎng)殖場(chǎng)和2個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)，采集羊糞樣品，提取DNA，以隱孢子蟲肌動(dòng)蛋白（actin）基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，鑒定綿羊和山羊感染的蟲種或基因型，評(píng)估其對(duì)人群的潛在威脅，為該地區(qū)羊隱孢子蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 用于陽性對(duì)照的C. parvum 基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物源性病原生物學(xué)與食品安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；FastDNA Spin Kit for Soil基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自MP公司；KOD DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司；pZero Back/blunt載體購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker DL2000購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，AxyPrep DNA膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司。

1.2 糞便樣本的采集 2016年5～6月，分別從山東省滕州市2個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)和2個(gè)綿羊養(yǎng)殖場(chǎng)采集新鮮糞便，共采集樣品222份，其中綿羊102份，山羊120份。樣品置于冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，1 w內(nèi)處理完。

1.3 樣品的處理 取5 g待檢樣品放入燒杯中，加50 mL PBS，壓舌板混勻后經(jīng)4層紗布過濾，濾液移入50 mL離心管中，2500×g，離心10 min。沉淀加10 mL PBS吹打混勻，吸取2 mL放入離心管中，-20℃保存，用于DNA提取。其余濾液離心后加入2.5%重鉻酸鉀溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品DNA的提取 取-20℃保存的2 mL濾液，用PBS反復(fù)洗3次，提取基因組DNA。提取方法參照FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 引物的設(shè)計(jì)和合成 參考Ng等[8]合成基因引物，其中第一輪PCR的上游引物（NAF1）：5'-ATG CCVGGWRTWATGGTDGGTATG-3'；下游引物（NAR1）：5'-GGDGCAACRACYTTRATCTT C-3'。第二輪PCR的上游引物（NAF2）：5'-GA YGARGCHCARTCVAARAGRGGTAT-3'；下游引物（NAR2）：5'-TTDATYTTCATDGTHGAHGG WGC-3'。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.6 樣品PCR擴(kuò)增 采用巢式PCR擴(kuò)增隱孢子蟲actin基因，其中第一輪為25 μL體系，第二輪為50 μL體系。具體如下：在第一輪反應(yīng)體系中加入2×PCR buffer（含Mg2+）12.5 μL，10 μmol/L引物NAF1、NAR1 各 0.5 μL，2 mmol/L dNTP 4 μL，1 U/μL KOD酶0.5 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL；第二輪反應(yīng)體系中加入2×PCR buffer（含Mg2+）25 μL，10 μmol/L引物NAF2、NAR2各 1 μL，2 mmol/L dNTP 8 μL，1 U/μL KOD酶1 μL，第一輪PCR產(chǎn)物模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)至50 μL。兩輪PCR反應(yīng)條件相同：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳鑒定。

1.7 目的基因克隆與序列鑒定 將擴(kuò)增為陽性的樣品進(jìn)行膠回收，克隆至pZero Back/blunt載體，轉(zhuǎn)入Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行37℃培養(yǎng)。挑取陽性菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)鑒定為陽性的菌液送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。所獲得序列通過Blast搜索比對(duì)，確定感染的蟲種或基因型。

1.8 不同種間actin基因的進(jìn)化樹分析 從GenBank下載不同種隱孢子蟲的actin基因，與本試驗(yàn)獲得的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。用軟件MEGA 7.0以鄰接法（neighbor-joining，NJ）分析本試驗(yàn)獲得的羊源隱孢子蟲actin基因與GenBank中的其他種的隱孢子蟲actin基因之間的親緣關(guān)系。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 利用Microsoft Excel 2013和SPSS 21.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)（χ2）方法，比較綿羊和山羊在不同養(yǎng)殖場(chǎng)、不同日齡之間的差異是否顯著。當(dāng)P≤0.05時(shí)，判定為差異顯著；當(dāng)P≤0.01時(shí)，判定為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 隱孢子蟲actin基因的PCR擴(kuò)增 以提取的綿羊和山羊樣品DNA為模板，進(jìn)行隱孢子蟲actin基因巢式PCR擴(kuò)增，結(jié)果陽性對(duì)照組和部分樣品成功地?cái)U(kuò)增出了特異性片段，大小約為820 bp，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 不同養(yǎng)殖場(chǎng)之間隱孢子蟲感染的分子流行情況對(duì)滕州市2個(gè)綿羊養(yǎng)殖場(chǎng)和2個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)采集的222份樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性樣品進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果顯示，該地區(qū)綿羊和山羊總感染率為6.76%（15/222），其中綿羊的感染率為7.84%（8/102），山羊的感染率為5.83%（7/120），二者差異不顯著（χ2=0.353，P＞0.05）。綿羊的2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)之間感染率分別為12.24%和3.77%，山羊的2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)之間感染率分別為8.33%和3.33%，4個(gè)場(chǎng)之間的差異均不顯著（χ2=4.444，P＞0.05）（表1）。將陽性樣品序列進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有樣品的序列與GenBank中序列同源性為100%，共發(fā)現(xiàn)3種隱孢子蟲感染，分別為C. parvum、C. xiaoi和C. ubiquitum。其中，6個(gè)C. parvum樣品（Goat-24、Goat-38、Goat-47、Goat-105、Sheep-45、Sheep-74）與KM010266同源性為100%，2個(gè)C. parvum樣品（Sheep-4、Sheep-73）與KU892568同源性為100%；3個(gè)C. xiaoi樣品（Goat-32、Goat-46、Goat-119）與GU553017同源性為100%，3個(gè)C. xiaoi樣品（Sheep-29、Sheep-30、Sheep-32）序列與GenBank中的序列（登錄號(hào)：GQ337964）同源性為100%；1個(gè)C.ubiquitum樣品（Sheep-27）與GenBank中的序列（登錄號(hào)：KY596684）同源性為100%（圖2）。在3種感染的隱孢子蟲中，C. parvum所占比例最高，達(dá)53.33%（8/15）；其次是C. xiaoi，為40.00%（7/15）；C. ubiquitum的比例最低，僅為6.67%（1/15）（表1）。在綿羊養(yǎng)殖場(chǎng)1中，存在3種隱孢子蟲感染，養(yǎng)殖場(chǎng)2僅存在C. parvum感染；而2個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)均存在C. parvum和C. xiaoi感染，未發(fā)現(xiàn)C.ubiquitum感染（表1）。

圖1 部分樣品actin基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of actin gene PCR amplification products of partial samples

表1 不同養(yǎng)殖場(chǎng)羊隱孢子蟲感染情況Table 1 Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in different farms

圖2 陽性樣品與GenBank中的actin基因核苷酸比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment results of actin gene between positive samples and GenBank loading sequences

2.3 不同日齡的感染情況 將調(diào)查的羊按＜6月齡、6～12月齡和＞12月齡3個(gè)年齡段分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果，綿羊感染率最高的年齡段為6～12月齡，達(dá)到20.69%（6/29），而＜6月齡和＞12月齡的感染率分別為2.70%（1/37）和2.78%（1/36），不同年齡段之間的感染率差異顯著（χ2=9.252，P＜0.05）；山羊感染率最高年齡段為＞12月齡，為10.00%（4/40），其次為6～12月齡，為7.50%（3/40），而＜6月齡的綿羊樣品未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染，不同年齡段之間的感染率差異不顯著（χ2=3.944，P＞0.05）（表2）。從感染的種類來看，綿羊樣品中＜6月齡和＞12月齡均發(fā)現(xiàn)1例C. parvum感染，而6～12月齡存在3種隱孢子蟲感染；山羊樣品中6～12月齡和＞12月齡均存在C.parvum和C. xiaoi感染（表2）。

表2 不同日齡羊隱孢子蟲感染情況Table 2 Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in different age goats and sheep

2.4 隱孢子蟲actin基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析 對(duì)PCR陽性樣品序列和部分GenBank中的序列采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，本研究所獲得序列分別與GenBank下載的C. parvum、C. xiaoi和C. ubiquitum序列在同一個(gè)分支上（圖3）。

3 討論

當(dāng)前，隱孢子蟲病已成為各個(gè)國(guó)家重要的公共衛(wèi)生問題，在無有效藥物治療的前提下，及早診斷、提前預(yù)防是控制該病的重要途徑。羊感染隱孢子蟲后，不僅對(duì)羊的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響，而且羊感染的隱孢子蟲多數(shù)是人獸共患蟲種，對(duì)人群造成潛在威脅。我國(guó)關(guān)于羊感染隱孢子蟲的報(bào)道，最早見于盧炳魁等[9]對(duì)內(nèi)蒙古部分地區(qū)的檢測(cè)，隨后我國(guó)青海、寧夏、貴州、四川、河南、吉林、重慶、安徽、吉林、遼寧、山東、江蘇、陜西等省市均有報(bào)道，感染率為0%～65%，這些檢測(cè)絕大多數(shù)以常規(guī)的鏡檢為主[10-21]。由于不同種隱孢子蟲之間大小差異并不明顯，光靠鏡檢很難鑒定出羊感染的蟲種或基因型，很難評(píng)估哪些蟲種對(duì)人類健康存在潛在的威脅，而且常規(guī)鏡檢以人的主觀判斷為主，容易造成實(shí)驗(yàn)誤差，這也可能是我國(guó)不同地區(qū)感染率差異顯著的原因之一。本次調(diào)查采用分子生物學(xué)方法，對(duì)山東滕州地區(qū)綿羊和山羊的隱孢子蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果顯示，該地區(qū)羊的總感染率為6.76%，其中綿羊的感染率為7.84%，山羊的感染率為5.83%。山羊樣品的檢測(cè)結(jié)果，低于Mi等[6]以SSU rRNA為靶基因的18.00%檢出率，這種檢出率的差異原因可能與所用的靶基因不同，使得PCR方法的靈敏度不同有關(guān)。

圖3 基于隱孢子蟲actin基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree of Cryptosporidium spp.constructed based on actin gene

近年來，應(yīng)用分子生物學(xué)檢測(cè)方法，鑒定隱孢子蟲感染的蟲種或基因型，得到越來越廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用這些方法，我國(guó)很多地區(qū)開展了羊源隱孢子蟲的分子流行病學(xué)調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，不同地區(qū)所感染的優(yōu)勢(shì)蟲種也有差別。2007年，Karanis等[22]報(bào)道青海山羊感染的隱孢子蟲為C. xiaoi和1個(gè)新基因型，這也是國(guó)際上首次報(bào)道山羊感染C.xiaoi感染病例；隨后報(bào)道山羊感染蟲種以C. xiaoi為主[6,23,24]；而Wang等[25]對(duì)河南和重慶地區(qū)山羊隱孢子蟲調(diào)查發(fā)現(xiàn)C. ubiquitum是優(yōu)勢(shì)種。綿羊感染情況也相似，C. xiaoi是綿羊感染的優(yōu)勢(shì)種[26,27]，而對(duì)河南和四川地區(qū)研究表明，C. ubiquitum是優(yōu)勢(shì)種[28,29]。目前對(duì)于隱孢子蟲蟲種或基因型的鑒定，多數(shù)基于SSU rRNA基因進(jìn)行鑒定，但是，本課題組在進(jìn)行隱孢子蟲分子流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，有時(shí)會(huì)擴(kuò)增出假陽性樣品（未知真核生物）。本試驗(yàn)嘗試選取actin基因做為靶基因，對(duì)滕州市羊源樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C. parvum所占的比例最高（53.33%），其次是C. xiaoi（40.00%），僅發(fā)現(xiàn)1例C. ubiquitum，這與之前種型研究結(jié)果不一致。檢測(cè)結(jié)果的差異可能和采樣的季節(jié)、動(dòng)物的年齡、選取的靶基因不同有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，SSU rRNA基因擴(kuò)增為陽性的樣品，有部分樣品actin基因并不能有效擴(kuò)增[8]，因此我們推測(cè)不同靶標(biāo)基因?qū)ν幌x種的擴(kuò)增效率不同，這還需要應(yīng)用SSU rRNA對(duì)本試驗(yàn)選取的樣品進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

從感染的不同日齡來看，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)綿羊感染率最高的年齡段出現(xiàn)在6～12月齡，C. xiaoi是優(yōu)勢(shì)種；而山羊則是＞12月齡感染率最高，＜6月齡的未發(fā)現(xiàn)感染，這與之前報(bào)道羔羊最易感結(jié)果不一致。崔彬等[14]報(bào)道2～4月齡山羊感染率最高，陳靜等[17]發(fā)現(xiàn)2～3月齡感染率最高。檢測(cè)結(jié)果的差異可能和我們所采集羊的年齡段范圍偏廣、低日齡羊的樣品采集偏少有關(guān)，具體原因尚需進(jìn)一步細(xì)化羊的年齡段，再次采樣驗(yàn)證。

綜上所述，本研究以隱孢子蟲actin基因?yàn)榘谢颍瑢?duì)來自滕州市的綿羊和山羊樣品進(jìn)行了檢測(cè)，總的感染率為6.76%，存在3種隱孢子蟲感染，分別是C. parvum、C. xiaoi和C. ubiquitum，其中C. parvum和C. ubiquitum均是人獸共患的蟲種，需要引起重視。本研究首次采用分子生物法調(diào)查了山東省滕州市不同日齡羊隱孢子蟲感染情況和種類，研究結(jié)果為科學(xué)評(píng)估該地區(qū)羊隱孢子蟲病的風(fēng)險(xiǎn)程度提供依據(jù)，也為制定預(yù)防和控制羊隱孢子蟲病措施提供了參考。