布洛芬對(duì)活性污泥中功能酶活性的影響

趙晶晶，董玉瑛，方政，鄒學(xué)軍

大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，大連116605

醫(yī)藥品、個(gè)人護(hù)理品以及內(nèi)分泌干擾物等新型有機(jī)污染物(emerging organic contaminants，EOCs)多為具有生物活性物質(zhì)，其進(jìn)入水體環(huán)境，可誘發(fā)水生生物發(fā)生不同應(yīng)激變化，對(duì)生態(tài)環(huán)境和生物健康的危害風(fēng)險(xiǎn)較大[1]。其中布洛芬(IBP，C13H18O2)是具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用的常用非甾體抗炎藥，使用劑量較大，達(dá)1 200 mg·d-1[2]，同時(shí)已有研究在不同來(lái)源水體中檢測(cè)到其存在[3-5]。各類(lèi)有機(jī)物需進(jìn)入城市污水廠經(jīng)生化處理達(dá)標(biāo)后排放，其過(guò)程中穩(wěn)定的污泥處理效果是保障出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)的重要基礎(chǔ)，而污水處理廠污泥中存在著數(shù)量眾多、遺傳與代謝方式多樣的微生物，它們?cè)谖廴疚锏娜コ邪l(fā)揮著關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)作用。但微生物無(wú)法完全去除大部分新型有機(jī)污染物，如國(guó)內(nèi)污水處理廠布洛芬的去除率約為41.6%[6-7]，去除率低。并且新型有機(jī)污染物多具有生物毒性[8-9]，會(huì)影響水處理效果。已有研究發(fā)現(xiàn)，污水中的有毒物質(zhì)超過(guò)一定濃度時(shí)，會(huì)影響和干擾微生物的正常代謝，進(jìn)一步影響污水生物處理效果[10]。

不同酶的功能有特異性，是污泥活性的直接反應(yīng)。活性污泥生物代謝功能與一系列酶活性密切相關(guān)[11]。這些酶擔(dān)負(fù)著凈化污水的使命，同時(shí)其功能也會(huì)受到污水中具有生物活性EOCs存在的影響[12]。因此，測(cè)定EOCs對(duì)污泥微生物群落的影響、篩選影響污泥生態(tài)功能的敏感指標(biāo)，可及時(shí)預(yù)警污水處理系統(tǒng)污泥活性出現(xiàn)異動(dòng)的情況。

因?yàn)槿绮悸宸业男滦陀袡C(jī)污染物使用量大、去除率低，且藥品的存在會(huì)影響活性污泥微生物的活性，而傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)存在不足。所以需要篩選敏感污泥活性指標(biāo)，以有效預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)。研究通過(guò)將活性污泥暴露于布洛芬存在的條件下進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析，主要選擇活性污泥中脲酶活性、轉(zhuǎn)化酶活性為主要分析指標(biāo)。對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析，為篩選敏感污泥活性指標(biāo)、有效預(yù)測(cè)可能出現(xiàn)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與材料

UV-1000分光光度計(jì)(上海，美普達(dá)儀器有限公司)；THZ-B臺(tái)式恒溫振蕩器(常州，諾基儀器有限公司)；PHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海，一恒科技有限公司)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海，精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

實(shí)驗(yàn)用布洛芬購(gòu)自海外制藥有限公司。其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)中所用活性污泥均取自大連某污水處理廠的曝氣池，其基本理化指標(biāo)：混合液懸浮固體(MLSS)1 609 mg·L-1；揮發(fā)性懸浮物(VSS)0.7 mg·L-1；污泥容積指數(shù)(SVI)80～120 mL·g-1；濁度3 500～3 700 mg·L-1，耗氧速率(OUR)3 mg·g-1·h-1。污泥在進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行充分的曝氣培養(yǎng)。

1.2 生化指標(biāo)分析方法

1.2.1 脲酶活性分析方法

脲酶的活性測(cè)定應(yīng)用苯酚鈉比色法[13]。通過(guò)多組空白試驗(yàn)，確定活性污泥脲酶活性的穩(wěn)定時(shí)間段，根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間要求控制污泥與藥品的暴露時(shí)間。將污泥與0～40 μg·L-1的布洛芬等體積混合暴露。隨后將污泥懸濁液與甲苯充分混合，加入10%的尿素溶液和檸檬酸緩沖溶液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取濾液加入苯酚鈉和次氯酸鈉，混勻后靜置。溶液在稀釋后于578 nm測(cè)吸光度。每組設(shè)置2個(gè)平行樣。同時(shí)設(shè)置無(wú)土對(duì)照與無(wú)基質(zhì)對(duì)照，用以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。無(wú)土對(duì)照即不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。無(wú)基質(zhì)對(duì)照即以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.2 轉(zhuǎn)化酶活性分析方法

轉(zhuǎn)化酶的活性測(cè)定應(yīng)用3,5-二硝基水楊酸法[13]。通過(guò)多組空白試驗(yàn)，確定活性污泥轉(zhuǎn)化酶活性的穩(wěn)定時(shí)間段，根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間要求控制污泥與藥品的暴露時(shí)間。將污泥與0～40 μg·L-1的布洛芬等體積混合，暴露15 h。隨后將污泥懸濁液中加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液、10%的蔗糖溶液和甲苯溶液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取濾液加入3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴加熱，然后冷卻，稀釋后于578 nm測(cè)吸光度。每組設(shè)置2個(gè)平行樣。同時(shí)設(shè)置無(wú)土對(duì)照與無(wú)基質(zhì)對(duì)照，用以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。無(wú)土對(duì)照即不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。無(wú)基質(zhì)對(duì)照即以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 酶活性表征

活性污泥中酶活性的計(jì)算方法參關(guān)松萌[13]的酶活性計(jì)算方法。酶活性以24 h后1 g烘干污泥對(duì)應(yīng)生成產(chǎn)物的質(zhì)量表示。

脲酶活性以24 h后1 g烘干污泥對(duì)應(yīng)NH3-N生成量的毫克數(shù)表示：

(1)

式中：a樣品為樣品吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3-N毫克數(shù)；a無(wú)污泥為無(wú)污泥對(duì)照吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3-N毫克數(shù)；a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3-N毫克數(shù)；V為顯色液體積(mL)；n為分取倍數(shù)，即浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干污泥的質(zhì)量(g)。

轉(zhuǎn)化酶活性以24 h后1 g烘干污泥對(duì)應(yīng)葡萄糖生成量的毫克數(shù)表示：

(2)

a樣品為樣品吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的葡萄糖毫克數(shù)；a無(wú)污泥為無(wú)污泥對(duì)照吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的葡萄糖毫克數(shù)；a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的葡萄糖毫克數(shù)；V為顯色液體積(mL)；n為分取倍數(shù)，即浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干污泥的質(zhì)量(g)。

圖1 酶活性與暴露時(shí)間關(guān)系Fig. 1 Relationship between enzyme activity and exposure time

圖2 不同濃度布洛芬對(duì)污泥脲酶活性的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of ibuprofen on urease activity

1.3.2 酶活性變化率分析

以布洛芬暴露濃度與酶活性的動(dòng)態(tài)變化率、總變化率的劑量-效應(yīng)關(guān)系表示酶活性在布洛芬暴露下的變化情況。

(3)

式中：R為酶活性變化率，Rn為本測(cè)定點(diǎn)酶活性值，Rn-1為上一測(cè)定點(diǎn)酶活性值，R0為布洛芬暴露濃度為零時(shí)的酶活性值。

酶活性動(dòng)態(tài)變化率表達(dá)的是酶活性在本測(cè)定點(diǎn)與上一測(cè)定點(diǎn)區(qū)間內(nèi)的變化情況，是對(duì)酶活性變化的動(dòng)態(tài)分析，強(qiáng)調(diào)相鄰測(cè)定點(diǎn)區(qū)間內(nèi)的變化情況。

(4)

式中：I為酶活性抑制率，I0為布洛芬暴露濃度為零時(shí)的酶活性值，In為本測(cè)定點(diǎn)酶活性值。

酶活性總變化率表達(dá)的是酶活性在某一濃度點(diǎn)與零濃度點(diǎn)相比的變化程度，是對(duì)酶活性總體變化情況的分析，強(qiáng)調(diào)總體趨勢(shì)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 污泥酶活性穩(wěn)定時(shí)間

通過(guò)多組空白試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定活性污泥酶活性的穩(wěn)定暴露時(shí)間，發(fā)現(xiàn)對(duì)于脲酶活性，暴露時(shí)間為5 h時(shí)，脲酶活性總變化率為15.2%；暴露時(shí)間為30 h時(shí)，脲酶活性總變化率為22.4%；其余暴露時(shí)間下，脲酶活性較為穩(wěn)定，總變化率不超過(guò)±3%。對(duì)于轉(zhuǎn)化酶活性，暴露時(shí)間為30 h時(shí)，轉(zhuǎn)化酶活性總變化率為16.7%；其余暴露時(shí)間下，轉(zhuǎn)化酶活性較為穩(wěn)定，總變化率不超過(guò)±6%。

因此我們選擇暴露時(shí)間在脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性同時(shí)穩(wěn)定的時(shí)間，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間要求控制污泥與藥品的暴露時(shí)間為15 h。

2.2 脲酶活性響應(yīng)

脲酶(urease)是一種能促進(jìn)含氮有機(jī)物水解的水解酶，對(duì)污水中含氮有機(jī)物的分解具有重要意義[14]。脲酶活性值與布洛芬濃度有顯著的相關(guān)關(guān)系。脲酶活性動(dòng)態(tài)變化率隨布洛芬濃度升高先小幅度提升，在布洛芬濃度達(dá)到28 μg·L-1后呈現(xiàn)出了單調(diào)遞減趨勢(shì)。在布洛芬濃度達(dá)到35～40 μg·L-1時(shí)，對(duì)脲酶活性的抑制程度超過(guò)了40%。試驗(yàn)結(jié)果表明，28～40 μg·L-1的布洛芬對(duì)活性污泥微生物的脲酶活性有顯著的抑制作用，隨著暴露濃度的增加，持續(xù)表現(xiàn)出抑制。而布洛芬與脲酶活性總變化率的劑量-效應(yīng)圖表明，脲酶活性在0～40 μg·L-1的布洛芬暴露下總體為抑制作用，布洛芬濃度達(dá)28 μg·L-1后，

圖3 不同濃度布洛芬對(duì)污泥轉(zhuǎn)化酶活性的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of ibuprofen on invertase activity

脲酶活性總變化率單調(diào)增加，存在顯著的劑量-效應(yīng)相關(guān)性。在布洛芬濃度達(dá)到40 μg·L-1時(shí)，脲酶活性總變化率超過(guò)了70%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，布洛芬脅迫濃度較低時(shí)，受外界條件刺激微生物代謝活性增強(qiáng)，微生物受到外界污染物影響時(shí)，為減少對(duì)自身的毒害，需要通過(guò)代謝作用將其分解，脲酶能促進(jìn)含氮有機(jī)物的水解，當(dāng)活性污泥中布洛芬脅迫濃度較低時(shí)，受外界條件刺激下，微生物代謝活性增強(qiáng)[15]，加速了布洛芬的降解和轉(zhuǎn)化；而隨著暴露濃度的繼續(xù)增加，有毒物質(zhì)導(dǎo)致了脲酶等水解酶的活性下降，脲酶的活性呈現(xiàn)單調(diào)遞減趨勢(shì)，這是因?yàn)楫?dāng)活性污泥中毒物質(zhì)量過(guò)高時(shí)，會(huì)破壞微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低其氧化代謝能力。此在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)布洛芬的存在會(huì)影響脲酶分解含氮有機(jī)物的活性，誘導(dǎo)了不利應(yīng)激變化。閆穎等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)低濃度除草劑阿特拉津?qū)ν寥离迕傅幕钚杂写龠M(jìn)作用，而高濃度阿特拉津降低了脲酶的活性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果也解釋了出水氨氮發(fā)生異常時(shí)，數(shù)據(jù)往往上升迅速的現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)污染物對(duì)脲酶活性影響的分析，可較為準(zhǔn)確和迅速地判斷污水處理的異動(dòng)情況。同時(shí)可以采取及時(shí)的控制措施，縮短系統(tǒng)的恢復(fù)時(shí)間。

2.3 轉(zhuǎn)化酶活性響應(yīng)

轉(zhuǎn)化酶(invertase)可增加污泥中易溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)污泥中的碳循環(huán)有重要作用[17]。而轉(zhuǎn)化酶活性值隨暴露濃度增加活性總體趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的耐受性。轉(zhuǎn)化酶活性動(dòng)態(tài)變化率范圍不超過(guò)±20%，轉(zhuǎn)化酶活性總變化率的變化表明，與空白相比轉(zhuǎn)化酶活性呈現(xiàn)出了一定的抑制現(xiàn)象，但總變化率變化趨勢(shì)不明顯。實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)在布洛芬濃度為35 μg·L-1時(shí)轉(zhuǎn)化酶活性總變化率達(dá)到峰值，但最大總變化率未超過(guò)30%。因此，轉(zhuǎn)化酶活性對(duì)布洛芬實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)濃度變化不敏感。陳青林[18]的阿特拉津?qū)ν寥烂富钚杂绊懙难芯恳脖砻?，土壤脲酶?duì)阿特拉津的敏感程度大于轉(zhuǎn)化酶對(duì)阿特拉津的敏感程度。

通過(guò)對(duì)比活性污泥中脲酶、轉(zhuǎn)化酶的活性變化率在布洛芬0～40 μg·L-1暴露下的變化，我們發(fā)現(xiàn)：不同種類(lèi)酶活性對(duì)布洛芬暴露的響應(yīng)不同，隨毒性作用的不斷增強(qiáng)，脲酶活性先被激活，后被抑制；轉(zhuǎn)化酶活性變化不明顯。轉(zhuǎn)化酶活性動(dòng)態(tài)和總變化率波動(dòng)幅度均低于脲酶活性動(dòng)態(tài)和總變化率，因此轉(zhuǎn)化酶活性指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)布洛芬的敏感程度低于脲酶活性指標(biāo)。脲酶活性在布洛芬較低暴露濃度下明顯顯示出抑制作用，且變化幅度大、響應(yīng)快，因此推薦使用脲酶活性指標(biāo)作為評(píng)價(jià)布洛芬等新型有機(jī)污染物對(duì)復(fù)雜污泥機(jī)制中活性污泥微生物活性影響的重要敏感酶指標(biāo)。