顧慶新，王鐵林，過雨晴，蔣萌萌，馬 麗，曲思，宋博翠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

過敏反應(yīng)是指機體在對某些抗原產(chǎn)生初次應(yīng)答后，再次接受相同抗原刺激時，機體產(chǎn)生一種以生理功能紊亂或組織細胞損傷為主要特征的特異性免疫應(yīng)答，臨床上主要表現(xiàn)為過敏性鼻炎、皮膚搔癢、蕁麻疹、支氣管哮喘等癥狀。由于其發(fā)病率較高，因此成為影響人類健康的重要疾病之一。

在四種不同類型的過敏反應(yīng)中最常見的為I型和IV型。其中，I型過敏反應(yīng)是免疫系統(tǒng)中最強烈的病理反應(yīng)之一，主要特征為機體針對抗原產(chǎn)生IgE抗體，Eos組織出現(xiàn)浸潤現(xiàn)象，釋放炎性介質(zhì)。通過研究發(fā)現(xiàn)，Eos在組織中出現(xiàn)浸潤主要是通過趨化因子與其表面高表達的受體CCR3的結(jié)合實現(xiàn)的，能與受體CCR3結(jié)合的趨化因子種類較多，但嗜酸粒細胞趨化因子（Eotaxin）是唯一能夠高選擇性與其特異性結(jié)合的配體，因此降低Eotaxin的表達是控制過敏性疾病進程中的重要環(huán)節(jié)。

目前對治療過敏性疾病，采用藥物治療是一種有效的控制手段。但現(xiàn)有的治療藥物中存在開發(fā)成本高、副作用大等問題，而中藥因其價格較低、副作用小等優(yōu)點，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。棉酚（Gossypol，GOS）是一種天然黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，主要存在于錦葵科植物棉花的根、莖和種子中，近年來發(fā)現(xiàn)GOS具有抗炎、抗病毒、抗瘧、抗氧化及抗腫瘤等藥理作用，但其抗過敏的藥理作用還未見報道]。前期研究我們發(fā)現(xiàn)，棉酚具有潛在的抗過敏作用，本研究通過檢測GOS對Ⅰ型過敏反應(yīng)小鼠血清中,Eotaxin及其特異性受體CCR3水平的影響，初步探討GOS對I型過敏反應(yīng)的抑制作用，將其作為潛在的抗過敏藥物進行研究與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物

健康Balb/c小鼠，雌雄各半8～10周齡，體重為18～20 g，均購于吉林大學(xué)實驗動物中心，小鼠適應(yīng)1周后進行試驗。

1.1.2 實驗試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；棉酚（中國藥品生物制品檢定所）；環(huán)磷酰胺（美國Sigma公司）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Axygen公司）；瓊脂糖（Biowest公司）；OVA(美國Sigma公司)；Al(OH)3凝膠（河南樂水環(huán)?？萍加邢薰荆籈otaxin試劑盒（美國Biolegend公司）；Trizol試劑（賽默飛世爾科技）；胎牛血清（美國Gibco公司）；PBS緩沖液（江蘇綠葉生物科技公司）；其它化學(xué)試劑均為分析純，購于吉林化學(xué)試劑廠。

1.2 方 法

1.2.1 Ⅰ型過敏反應(yīng)小鼠模型的建立

實驗動物選取BALB/c小鼠，體重為18～20g，共60只。隨機分為6組，每組10只。分別為對照組、模型組、地塞米松組、棉酚低、中、高劑量組。取0.1mL含lmg/mL-1的OVA的免疫原液和0.05mg mL-1的Al(OH)3，對模型組和棉酚低、中、高劑量組小鼠進行免疫。初次免疫方式是對每只小鼠背部兩側(cè)分多點進行皮下注射，初次免疫后第3周，取0.1mL相同的免疫原對模型組和藥物組小鼠后腿肌肉部位進行注射來加強免疫，對照組小鼠以同樣方法用生理鹽水進行免疫。除對照組外，在建模第1天開始小鼠腹腔注射給藥0.1mL。

1.2.2 血樣采集

小鼠加強免疫后7d，末次給藥1h后，通過摘取小鼠眼球方式進行采血，血樣分別放入一個無菌離心管和一個含肝素的離心管中。其中，無菌離心管血樣于4℃冰箱中靜置過夜。第2天，將血樣放置離心機中，轉(zhuǎn)速1000×g，離心20 min，使用移液器將分離后的血清移至新的離心管中待用。含肝素的離心管血樣使用淋巴細胞分離液分離出外周血單一核細胞（PBMC）后，將樣品放入Trizol試劑里，-80℃冰箱中保存待用。

1.2.3 ELISA法檢測血清中IgE、Eotaxin和CCR3的含量

將血清用樣品稀釋液稀釋20倍后，采用雙抗體夾心ELISA法檢測炎性介質(zhì)IgE、Eotaxin和CCR3濃度。具體做法是將一抗包被于酶標(biāo)板4℃過夜后，第2d加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品37℃孵育2h讓其充分與一抗結(jié)合，加入生物素化的抗體形成免疫復(fù)合物，加入辣根過氧化物酶使其出現(xiàn)黃色，加終止液，待顏色變深，使用酶標(biāo)儀在450nm處測OD值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中待測蛋白的濃度。

1.2.4 RT-PCR法檢測外周血中Eotaxin和CCR3 mRNA表達

細胞總RNA提取采用Trizol試劑并嚴格按照試劑說明書進行。根據(jù)Genbank中嗜酸性粒細胞趨化因子Eotaxin、CCR3的核苷酸序列進行引物設(shè)計，引物的序列見表1，由上海生物工程有限公司合成，實驗樣品在1%的瓊脂糖凝膠中電泳后進行凝膠成像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）來表示，各組間比較采用方差分析進行統(tǒng)計，p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.01具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 ELISA法檢測血清中IgE的含量

表1 PCR引物序列

通過ELISA試劑檢測血清中IgE含量的影響，結(jié)果如圖1所示，與空白對照組相比，OVA組血清中IgE含量較空白對照組高，說明小鼠模型建立成功。使用棉酚作用后，Ⅰ型過敏小鼠血清中IgE的含量明顯下降，中、高劑量棉酚藥物組作用效果極其顯著（p＜0.01）。

2.2 ELISA法檢測血清中Eotaxin的含量

棉酚對血清中Eotaxin含量的影響結(jié)果如圖2所示。與空白對照組相比較，模型組小鼠血清中Eotaxin的濃度顯著提高。當(dāng)使用棉酚作用后，血清中Eotaxin的濃度均有所下降，其中，中、高劑量組作用極為顯著（p＜0.01），并且抑制Eotaxin的濃度與棉酚的濃度呈劑量依賴關(guān)系。

圖1 ELISA法檢測血清中IgE含量

圖2 ELISA法檢測血清中Eotaxin的含量

2.3 RT-PCR法檢測外周血中Eotaxin mRNA表達

通過RT-PCR檢測棉酚對外周血中Eotaxin mRNA表達的影響，結(jié)果如圖3所示。與空白對照組相比，模型組Eotaxin mRNA表達水平顯著升高。當(dāng)使用棉酚作用后，與模型組相比較，Eotaxin mRNA的表達水平均顯著下降（p＜0.01），其中，棉酚中、高劑量組的效果比環(huán)磷酰胺還好。

2.4 RT-PCR法檢測外周血中CCR3 mRNA表達

圖3 RT-PCR法檢測外周血中Eotaxin mRNA表達

圖4 RT-PCR法檢測外周血中CCR3 mRNA表達

棉酚對外周血中CCR3 mRNA表達的影響如圖4所示。與空白對照組比，OVA組CCR3 mRNA表達顯著提高。與OVA模型組相比，當(dāng)使用棉酚作用后，棉酚低劑量組的CCR3 mRNA的表達顯著下降（p＜0.05），而高、中劑量組作用極其顯著（p＜0.01）。

3 小結(jié)

本實驗通過對I型過敏小鼠背部兩側(cè)皮下多點注射的方式建立模型。其研究結(jié)果可以看出，空白對照組相比較，模型組血清中的的Eotaxin濃度、外周血中Eotaxin和CCR3 mRNA表達水平顯著升高。當(dāng)使用棉酚治療后發(fā)現(xiàn)，棉酚能夠降低通過降低Eotaxin和CCR3 mRNA的表達，其高劑量組作用最為顯著，其效果呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。說明棉酚能夠通過抑制Eotaxin和CCR3 mRNA的表達，減輕EOS的分化、活化、募集及局部浸潤，從而控制癥狀，減輕過敏反應(yīng)發(fā)展，達到治療過敏性疾病的目的。