吳翟 王彩榮 張靈敏 楊建新 周恒 王麗

【摘 要】 目的：通過(guò)觀察金蛭方對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白含量的影響，探討金蛭方治療缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制。方法：采用線栓法復(fù)制缺血性中風(fēng)大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、金蛭方高劑量組、金蛭方低劑量組、陽(yáng)性藥尼莫地平片對(duì)照組。應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測(cè)caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白含量變化。結(jié)果：模型組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）。用藥后各治療組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。高、低劑量組在增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)和降低caspase-3、Bax蛋白表達(dá)方面的作用優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論：金蛭方通過(guò)調(diào)節(jié)缺血性中風(fēng)大鼠caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)達(dá)到拮抗缺血性中風(fēng)作用。

【關(guān)鍵詞】 金蛭方；缺血性中風(fēng)；caspase-3、Bax、Bcl-2

【中圖分類號(hào)】R965 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）11-0006-04

Abstract：Objective To observe the effect of Jinzhifang on the content of Bax， bcl-2， caspase-3 protein in cerebral cortex region of ischemic stroke rats， and to investigate the mechanism of the treatment of ischemic stroke with Jinzhifang. Methods Using the suture method to copy the rat model of ischemic stroke were randomly divided into sham operation group， model control group， the Jinzhi fang decoction high dose group， the Jinzhi fang low dose group， positive drug nimodipine tablets in the Jinzhi fang. The content changes of caspase-3， Bax and bcl-2 were detected by using western-blot technique. Results The expression of Bcl-2 protein in ischemic cortex in model group was significantly lower than that in sham group（P<0.01）. The expression of caspase-3 and Bax protein was significantly higher than that of sham operation group （P<0.01）. The expression of Bcl-2 protein in the ischemic cortex of rats increased obviously after the treatment（P<0.05，P<0.01）.The expression of caspase-3 and Bax protein decreased obviously（P<0.05，P<0.01）.The effect of Bcl-2 protein expression and decrease of caspase-3 and Bax protein in high and low dose group was better than that in control group。Conclusion The Jinzhi fang through regulation of ischemic stroke rat Expression of casase-3， Bax， Bcl-2 proteins and release in order to achieve the antagonistic effect of ischemic apoplexy.

Keywords：Jinzhifang； Ischemic Stroke； Caspase-3、Bax、Bcl-2

缺血性中風(fēng)所致腦損傷的病理機(jī)制尚不完全清楚，目前有多種研究，其中細(xì)胞調(diào)亡在缺血半暗帶損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中起著十分重要的作用[1]，因此關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制的探索及基于抗調(diào)亡為靶點(diǎn)的治療藥物探究是缺血性中風(fēng)的研究熱點(diǎn)。金蛭方系課題組經(jīng)過(guò)多年篩選出的治療缺血性中風(fēng)的效方，臨床應(yīng)用10余年，療效明顯，但其作用機(jī)制不十分明確，本研究以期從細(xì)胞凋亡角度探討金蛭方對(duì)缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級(jí)，體重250～300 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：1119069。

1.2 藥物與試劑 金蛭方組成：水蛭、郁金、川芎、冰片（由遷安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備），上4味除冰片外水提濃縮成高、低劑量后加入相應(yīng)研磨冰片，所含生藥分別為：0.30 g/mL（高劑量）、0.15 g/mL（低劑量）。尼莫地平片（鄭州瑞康制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字：H41022175，規(guī)格：20 mg/片）。按體重0.00 1g/mL配制成水溶液。

Caspase-3（ab13585），Bcl-2抗體（ab692），Bax抗體（ab77566），Actin 抗體（ab5694），bolt 封閉液（ab184868）均由艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司提供。

1.3 主要儀器 DYCZ-24DN型雙垂直電泳槽（濟(jì)南德高實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司），DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽（濟(jì)南德高實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司），LT-X型實(shí)驗(yàn)室溫控?fù)u床（Adolf Kuhner公司），WH-300-LCD型電泳儀（上海雙琪生物科技有限公司），AR0136-04型PVDF膜（博士德生物工程公司）。

1.4 造模方法 參考改良的Longa法[2]：頸部正中切口，用3-0手術(shù)絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈（ECA）遠(yuǎn)端及枕動(dòng)脈，在結(jié)扎線距分叉部2 mm處剪斷ECA，將一端已加工成光滑球形的尼龍線從ECA殘端插入進(jìn)行結(jié)扎，將尼龍線經(jīng)頸總動(dòng)脈（CCA）分叉部插入頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），此時(shí)松開(kāi)CCA，ICA套線恢復(fù)血流，線栓推送順滑，無(wú)出血。將線栓向上深入至分叉以上18～19 mm達(dá)到大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，將頸總動(dòng)脈連同尼龍線一起結(jié)扎，縫合切口后外留尼龍線0.5 cm，放到單籠中，2 h后外拉尼龍線使其球端回至ECA進(jìn)行缺血后再灌注。參照Longa評(píng)定法，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評(píng)價(jià)，分為5個(gè)等級(jí)4分：0分，無(wú)明顯可見(jiàn)的缺損改變；1分，對(duì)側(cè)前肢可見(jiàn)屈曲、內(nèi)收；2分，向偏擁側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向偏雜側(cè)傾倒；4分，不能自主行走，意識(shí)不清；1～3分造模成功，0分與4分均為不合格模型，需要剔除。造模成功率100%。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥[3] 60只大鼠自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)于18～22 ℃明暗各12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組。①假手術(shù)組：手術(shù)時(shí)僅作頸部手術(shù)切口，鈍性分離頸前肌，游離暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，術(shù)后當(dāng)日灌服蒸餾水；②模型對(duì)照組（簡(jiǎn)稱模型組）：造模當(dāng)日灌服蒸餾水；③金蛭方低劑量組（簡(jiǎn)稱低劑量組）：造模當(dāng)日灌服金蛭方，每日用藥劑量為1.5 g/kg（相當(dāng)于成人劑量的10倍）；④金蛭方高劑量組（簡(jiǎn)稱高劑量組）：術(shù)后當(dāng)日灌服金蛭方，每日用藥劑量為3.0 g/kg （相當(dāng)于成人劑量的20倍）；⑤陽(yáng)性藥尼莫地平片對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組）：術(shù)后當(dāng)日灌服尼莫地平片，每日用藥劑量為0.01g/kg （相當(dāng)于成人劑量的20倍）。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 mL/100g計(jì)算，連續(xù)給藥2周。因給藥操作不當(dāng)，模型組低劑量組各死亡1只大鼠，高劑量組死亡2只大鼠。

1.6 檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)2周末，于最后1次給藥禁食12 h后，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速斷頭冰浴中取右腦皮質(zhì)與白質(zhì)部分，濾紙吸干血跡，將大鼠皮質(zhì)部分放入凍存管，存入液氮中備用。

1.7 western-blot檢測(cè)蛋白含量

1.7.1 溶液配制 ①1.5M Tris-HC1（PH8.8）：準(zhǔn)確稱量Tris堿18.15g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調(diào)PH值至8.8，定容至，100 mL。②1.0M Tris-HC1（PH6.8）；準(zhǔn)確稱量12.1g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調(diào)PH值至6.8，定容至，100 mL。③10%過(guò)硫酸胺：準(zhǔn)確稱量過(guò)硫酸胺0.1g溶于1 mL去離子水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。④10%SDS：180 mL水中溶解20g電泳級(jí)SDS，加熱至68 ℃水浴助溶，用濃鹽酸調(diào)至PH值至7.2，加水定容至200 mL。⑤Tris甘氨酸電泳緩沖液（5×）：準(zhǔn)確稱量堿15.1 g，甘氨酸94 g，SDS5 g，適量去離子水溶解，定容至1000 mL。⑥電轉(zhuǎn)移緩沖液：準(zhǔn)確稱量甘氨酸2.9g， Tris堿5.8 g，SDS0.37 g，甲醇200 mL，加去離子水定容至1000 mL。⑦TBS-T（0.05%）：準(zhǔn)確稱量Tris堿2.42 g，NaCl8 g，適量去離子水溶解，鹽酸調(diào)PH值至7.6，Tween-20 0.5 mL，加水定容至1000 mL。

1.7.2 祥本蛋白提取 依照電泳上樣量需要，用水及5×loading buffer調(diào)整蛋白濃度，100 ℃煮沸變性5 min。

1.7.3 丙烯酰胺凝膠電泳 ①根據(jù)目的蛋白的分子量，配制15%的分離膠，5%濃縮膠。②待檢測(cè)蛋白樣品上樣量：上樣50 μg。③電泳條件；濃縮膠恒壓80 v，約20 min；分離膠恒壓120 v，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。

1.7.4 濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜 ①轉(zhuǎn)膜方法；準(zhǔn)備一張大小合適的PVDF膜，浸泡于甲酵中30sec，再轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)液中，備兩張與膜大小一樣的厚濾紙浸泡于電轉(zhuǎn)液中備用；切除多余凝膠部分，按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序放入海綿墊夾層中，起盡氣泡。②轉(zhuǎn)膜條件：按照電流300 mA恒流轉(zhuǎn)膜；0.22 um孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間40 min

1.7.5 WB檢測(cè)目的蛋白 ①封閉；轉(zhuǎn)移結(jié)束后將PVDF膜浸泡于Western blot封閉液中，搖床中輕搖1 h。②一抗稀釋：用1%BSA/5%milk化稀釋一抗。③一抗孵育：封閉結(jié)束后，將PVDF膜置于雜交袋中，加入2中配制好的一抗，用封膜機(jī)封口，4 ℃解育過(guò)夜。④洗膜；TBST洗膜3次，每次6 min。⑤二抗孵育：用Western blot封閉液稀釋二抗，羊抗兔-HRP、羊抗小鼠-HRP1：5000稀釋，室溫輕搖50 min。⑥洗膜：TBST洗膜3次，每次5 min。⑦ECL反應(yīng)、膠片曝光：將PVDF膜浸泡于ECL顯色液中1 min，暗室中曝光、顯影并定影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，多組間比較用方差齊性檢驗(yàn)，單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）。用藥后各治療組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。高、低劑量組在增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)和降低caspase-3、Bax蛋白表達(dá)方面的作用優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05）。詳見(jiàn)圖1，表1。

3 討論

課題組通過(guò)對(duì)中風(fēng)病臨床癥候?qū)W研究認(rèn)為缺血性中風(fēng)患者多是在氣血內(nèi)虛的基礎(chǔ)上，加之勞倦內(nèi)傷、憂思惱怒、嗜食厚味、煙酒等誘因，導(dǎo)致氣血逆亂，直沖犯腦，致氣血瘀滯，腦脈痹阻。氣滯、血瘀、絡(luò)阻為本病的主要病機(jī)，“氣行則血行”，行氣、活血、通絡(luò)為其有效治則，筆者根據(jù)金蛭方，研制院內(nèi)制劑“金蛭膠囊”（制劑號(hào)：冀藥制字Z20051013）治療缺血性中風(fēng)10余年，療效滿意。方中水蛭破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)，《本草匯言》曰：“水蛭逐惡血、散瘀血之要藥也”；郁金行氣活血，化痰降火，《本草匯言》曰：郁金其性清揚(yáng)，能散郁滯，順逆氣，上達(dá)高巔，善行下焦；川芎行氣活血，歷代醫(yī)家認(rèn)為其：“善治中風(fēng)，治風(fēng)圣藥”[4]；冰片醒神通竅，《本草衍義》曰：“芳香走竄，引藥上行，獨(dú)行則勢(shì)弱，佐使則有功”，四藥合用，共奏活血、化瘀、通絡(luò)之功。

程序性死亡是保持細(xì)胞生存和死亡間平衡的關(guān)鍵因素。而凋亡作為程序性死亡的最主要類型，一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[5]。在缺血性腦損傷中，與壞死的細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞僅占死亡細(xì)胞總數(shù)的小部分[6]，而就缺血半暗帶而言，凋亡細(xì)胞死亡卻是最主要的死亡方式[7]。Caspase-3是Caspase家族成員之一，它在細(xì)胞調(diào)亡執(zhí)行階段中起著核心作用，活化的Caspase-3導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞DNA斷裂，抑制細(xì)胞増殖，并且破壞細(xì)胞之間的平衡狀態(tài)[8]。Caspase-3表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞調(diào)亡是缺血性和出血性腦損傷的重要標(biāo)志[9]。Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的調(diào)控基因，Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞調(diào)亡的功能，Bax蛋白則具有促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的功能[10]。Bcl-2通過(guò)介導(dǎo)線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔道復(fù)合體的開(kāi)放，抑制和調(diào)亡誘導(dǎo)因子AIF等促調(diào)亡蛋白的釋放阻止調(diào)亡的進(jìn)程。Bax只有收到調(diào)亡信號(hào)刺激被激活后，發(fā)生分子構(gòu)造改變，移位并插入線粒體外膜后形成Bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2等抑制調(diào)亡的蛋白對(duì)抗，阻止其抗調(diào)亡作用的發(fā)揮。因此，檢測(cè)caspase-3和Bcl-2、Bax缺血性卒中后的表達(dá)情況，即可說(shuō)明細(xì)胞調(diào)亡的狀況。

本研究表明，缺血性中風(fēng)大鼠模型缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低。經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組可降低大鼠模型缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)表達(dá)，表明金蛭方通過(guò)調(diào)節(jié)caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，以達(dá)到減輕腦缺血細(xì)胞凋亡、改善神經(jīng)功能、預(yù)防和治療缺血性中風(fēng)的作用，但其深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探討。

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