陸永娟 陳芝蕓 何蓓暉# 嚴(yán)茂祥

1 浙江省嘉善縣第一人民醫(yī)院 浙江 嘉善 314100 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是無(wú)過量飲酒史、以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，是臨床常見的慢性肝病之一[1]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，肝臟脂質(zhì)沉積是其發(fā)病的基礎(chǔ)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，膽汁淤積、胰島素抵抗、游離脂肪酸增多、氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化等代謝異常可以導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生、發(fā)展，法尼酯衍生物受體（FXR）可以調(diào)節(jié)膽汁酸、糖、脂的代謝，可能參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。山楂葉總黃酮（TFHL）具有抗脂質(zhì)過氧化、抑制或清除氧自由基、調(diào)節(jié)血脂、改善肝微循環(huán)及抗炎等作用。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，TFHL能明顯改善高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，抗氧化應(yīng)激，抑制炎性細(xì)胞因子的分泌等作用[2-3]。為進(jìn)一步探討TFHL的作用機(jī)制，本研究觀察其對(duì)NAFLD模型大鼠肝組織FXR/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1c）通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物：雄性SD大鼠40只，體重170±10g，SPF級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥品與試劑：TFHL(Lot：#20111211)，總黃酮含量＞95%，由山西康立生藥業(yè)有限公司提供；總RNA提取試劑盒（Cat：KD10111101-G）由愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司提供；cDNA合成試劑盒（Cat：BK1401）和熒光定量PCR試劑盒（Cat：BKA3206）由寶生物工程(大連)有限公司提供；引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)并合成，F(xiàn)XR上游引物：5’-AAGTGACCTCCCGACCA AGA-3’,下游引物：5’-TGGCATTCTCTGTTTGCTGT-3’,擴(kuò)增片段107b；小異二聚體伴侶分子（SHP）上游引物：5’-TGCCTGGAGTCTTTCTGGAG-3’,下游引物：5’-ATGTTCTTGAGGGTGGAAGC-3’,擴(kuò) 增 片 段227bp；SREBP-1c上游引物：5’-GCTTCTCTGGGCTCC TCTCT-3’，下游引物：5’-GCACTGGCTCCTCTTTGA TT-3’,擴(kuò)增片段154bp；脂肪合成酶(FAS)上游引物：5’-AGTGGGAAGACCCTGACTCC-3’,下游引物：5’-ATAGACGCCCTGGAAATGAG-3’，擴(kuò)增片段 152bp；β-actin上游引物：5’-TGTTGCCCTAGACTTCTT CGAGCA-3’,下游引物：5’-CCATACCCAGGAAGGAAG GCT-3’,擴(kuò)增片段112bp。蛋白抽提試劑盒（Cat：P1250）由北京普利萊基因技術(shù)有限公司提供；PotentECLKit（Cat：P1425）由聯(lián)科生物技術(shù)有限公司提供；FXR兔抗多克隆抗體H-130(sc-13063)和SREBP-1c兔抗多克隆抗體K-10(sc-367)由美國(guó)SantaCruz公司提供；FAS兔抗多克隆抗體c20G5(#3180S)由美國(guó)CellSignaling公司提供。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備：AB17900PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），LEECARM2025病理切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），日立7020全自動(dòng)生化分析儀（日本高新技術(shù)株式會(huì)社），OSE-Y10G電動(dòng)組織研磨器（天根生化科技有限公司），Mini-PROTEANTetra（美國(guó)BioRad公司），F(xiàn)CE型ProteinSimple化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海百賽生物技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、TFHL高、中、低劑量組共5組，每組8只。正常組予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其他4組每天予高脂飼料（在82.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上添加10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉和5%蛋黃粉）連續(xù)喂養(yǎng)12周，同時(shí)從造模第5周起TFHL高、中、低劑量組每日分別灌服160mg/kg、80mg/kg、40mg/kg的TFHL，正常組和模型組以等量的蒸餾水灌胃，均連續(xù)灌胃8周。實(shí)驗(yàn)第12周末，空腹麻醉下腹腔靜脈采血，檢測(cè)甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平；并收集肝臟標(biāo)本，肝右葉部分組織在10%中性甲醛中固定用于病理觀察。部分以生理鹽水制成10%肝組織勻漿，再以異丙醇提取、氧化鋁吸附后，分別采用磷脂-乙酰丙酮顯色法測(cè)定TG含量，高鐵-硫酸顯色法測(cè)定CHOL含量。部分肝組織提取總RNA后再合成cDNA，Realtime-PCR檢測(cè)肝組織中FXR、SHP、SREBP-1c、FAS的mRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量（2-△△Ct）來(lái)表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。部分肝組織提取蛋白后用WesternBlot檢測(cè)肝組織中FXR、SREBP-1c、FAS的蛋白表達(dá)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光得到蛋白條帶圖，用Quantityone軟件分析灰度值，用目的蛋白/GAPDH代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量代表目的蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示。多組樣本間的比較釆用單因素方差分析(one-wayANOVA)，各組之間兩兩比較，若方差齊性時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊性時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFHL對(duì)NAFLD大鼠肝組織CHOL、TG水平的影響：

NAFLD模型組大鼠肝臟TG、CHOL水平較正常組顯著增高（P＜0.05,P＜0.01）；TFHL各劑量組大鼠肝臟TG含量較模型組明顯減少（P＜0.05），TFHL高、中劑量組大鼠肝臟CHOL含量較模型組明顯減少（P＜0.01，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清中ALT、AST、CHOL和TG水平比較：詳見表1。

表1 山楂葉總黃酮對(duì)NAFLD大鼠血清ALT、AST、CHOL和TG水平的影響(±s，U/L)

表1 山楂葉總黃酮對(duì)NAFLD大鼠血清ALT、AST、CHOL和TG水平的影響(±s，U/L)

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

0.69±0.14 0.59±0.15 0.61±0.06 0.62±0.11 0.59±0.07正常組模型組TFHL低劑量組TFHL中劑量組TFHL高劑量組8 8 8 8 8 36.88±7.04 183.00±71.51*104.13±29.44△97.25±40.65△83.00±14.16△94.13±11.57 284.50±36.73*206.13±44.86△183.38±58.39△174.38±19.11△1.28±0.39 1.58±0.26*1.53±0.27 1.47±0.20 1.40±0.18

2.3 各組肝組織病理變化：光鏡下觀察，正常組肝小葉完整，肝細(xì)胞排列整齊，未見肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞病變，中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常。模型組肝小葉輪廓不清，肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松，富含脂肪粒，出現(xiàn)重度脂肪變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、小葉內(nèi)散在壞死灶和部分肝細(xì)胞氣球樣變等NAFLD的病理改變；經(jīng)TFHL治療后肝細(xì)胞腫大減輕，肝細(xì)胞脂肪沉積減少，小葉內(nèi)壞死灶和氣球樣變減輕。見圖1、圖2。

2.4 TFHL對(duì) NAFLD大鼠肝組織 FXR、SREBP-1c、FAS、SHPmRNA表達(dá)的影響：NAFLD模型組大鼠肝組織FXR、SHPmRNA水平較正常組顯著下降（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織FXR、SHPmRNA水平較模型組明顯增加（P＜0.05）；各劑量組大鼠肝組織FXR、SHPmRNA都低于正常組水平。模型組大鼠肝組織SREBP-1c、FAS mRNA水平較正常組顯著增加（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織SREBP-1cmRNA水平較模型組明顯下降（P＜0.05）。TFHL高、中劑量組大鼠肝組織FAS mRNA水平較模型組明顯下降（P＜0.05），但各劑量組大鼠肝組織SREBP-1c、FASmRNA都高于正常組水平。見圖3。

圖1 各組大鼠肝組織脂肪沉積的變化（油紅O×400）

圖2 各組大鼠肝臟組織病理的變化（HE×400）

圖3 TFHL對(duì)NAFLD大鼠肝組織FXR、SHP、SREBP-1、FAS基因mRNA表達(dá)的影響(n=8)

2.5 TFHL對(duì)NAFLD大鼠肝組織FXR、SREBP-1c、FAS蛋白表達(dá)的影響：NAFLD模型組大鼠肝組織FXR蛋白含量較正常組顯著減少（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織FXR蛋白含量較模型組明顯增加（P＜0.01），但都低于正常組水平。模型組大鼠肝組織SREBP-1c蛋白含量較正常組顯著增加（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織SREBP-1c蛋白含量較模型組明顯減少（P＜0.05），但都高于正常組水平。模型組大鼠肝組織FAS蛋白含量較正常組有增加趨勢(shì)；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織FAS蛋白含量較模型組有減少趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖4。

圖4 TFHL對(duì)NAFLD大鼠肝組織FXR、SREBP-1c、FAS蛋白水平表達(dá)的影響(n=8）

3 討論

隨著人民生活水平的提高，NAFLD的發(fā)病率也在逐漸升高。NAFLD與糖尿病、心腦血管疾病密切相關(guān)，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)[4-5]。而FXR可以調(diào)節(jié)膽汁酸、糖、脂的代謝。FXR是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)調(diào)控膽汁酸、脂質(zhì)和糖的代謝[6]。在肝臟，F(xiàn)XR通過誘導(dǎo)SHP的表達(dá)，下調(diào)膽汁酸合成途徑中的關(guān)鍵酶膽固醇-7α-羥化酶（CYP7A1），從而控制膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼醄7-8]。同時(shí)，F(xiàn)XR通過SHP下調(diào)SREBP-1c的表達(dá)，SREBP-1c可調(diào)節(jié)相關(guān)成脂基因的水平，包括脂肪合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧基酶等，從而實(shí)現(xiàn)FXR對(duì)肝臟甘油三酯水平的調(diào)控[9]。FXR還能調(diào)節(jié)磷脂轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)，加速磷脂和膽固醇從富含TG的脂蛋白向高密度脂蛋白（HDL）轉(zhuǎn)運(yùn)；上調(diào)肝細(xì)胞膜上的清道夫受體B，從而增加HDL介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，激活FXR就能發(fā)揮抑制膽汁酸的合成、降低甘油三酯等多種藥理活性[10]。對(duì)于NAFLD的治療，近年來(lái)的臨床報(bào)道顯示中醫(yī)藥的療效值得肯定，如桂祖全等[11]采用健脾化痰活血法為主治療非酒精性脂肪性肝病肝郁脾虛證68例，總有效率90.16%，臨床療效良好。TFHL在臨床上主要用于降血脂、降血糖、改善脂肪肝、抗心絞痛、抗腫瘤等多種疾病的防治方面。有研究表明，TFHL作為藥用植物山楂葉的提取物，可以調(diào)節(jié)NAFLD/NASH大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，調(diào)控Nrf2及相關(guān)因子的表達(dá)，緩解NAFLD/NASH大鼠的氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少細(xì)胞因子對(duì)肝細(xì)胞的損傷等[12]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M肝組織出現(xiàn)典型的NAFLD病理表現(xiàn)，血清和肝組織TG、CHOL含量增加，血清ALT、AST等水平增高，同時(shí)大鼠肝組織FXR、SHP表達(dá)顯著下降，而SREBP-1c、FAS表達(dá)則明顯增加，表明長(zhǎng)期高脂飲食可導(dǎo)致大鼠肝組織FXR的表達(dá)下降，SHP水平受到抑制，進(jìn)一步促進(jìn)SREBP-1c、FAS的表達(dá)，影響肝臟脂質(zhì)代謝的平衡，TG、CHOL等在肝臟沉積，肝酶水平升高，提示肝臟FXR表達(dá)降低可能是脂肪肝形成的重要機(jī)制，F(xiàn)XR-SHPSREBP-1c-FAS通路參與高脂誘導(dǎo)的NAFLD的發(fā)生發(fā)展。應(yīng)用TFHL干預(yù)后，大鼠肝組織FXR、SHP表達(dá)明顯增加，而SREBP-1c、FAS表達(dá)顯著減少，同時(shí)TG、CHOL含量和血清ALT、AST水平顯著下降，表明TFHL可能通過增加FXR的表達(dá)，誘導(dǎo)SHP，抑制SREBP-1c、FAS的過表達(dá)，從而改善肝臟脂質(zhì)代謝和肝功能紊亂，防止NAFLD的進(jìn)展。研究提示，TFHL可能是通過調(diào)控FXR與SREBP-1c通路，改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)揮防治NAFLD的作用。