史國軍 葉興濤 屠小龍 施 航 董 晶 陸 寧 何國濃

浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315010

冬凌草甲素是中藥冬凌草的主要活性成分，在冬凌草中占0.68%[1]，對肝癌、肺癌等多種癌細胞具有很強的抑制功效，作用機制復雜。本研究重點觀察冬凌草甲素對人肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移能力的影響及其作用機制。報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及藥物：人肝癌細胞株SMMC-7721購自中國科學院上海細胞生物研究所。冬凌草甲素（Oridonin）購于Sigma公司，貨號：28957-04-2。

1.2 主要試劑及儀器：四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購于美國Hyclone公司，10%胎牛血清購自杭州四季青公司。Vimentin一抗：杭州華安生物技術有限公司，貨號：ET1610-39。E-Cadherin一抗：杭州華安生物技術有限公司，貨號：ET1607-75。倒置顯微鏡(COIC4365)購于日本Nikon公司，精密電子天平（美國Ohaus，型號AR1140），OD值測量儀器(高精度分光光度計)為NANODROP2000。

1.3 方法：分述如下。

1.3.1 細胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出細胞株，快速解凍復蘇于細胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h換液1次。待細胞融合度達到80%～90%時，加入適量的0.25%胰酶消化，離心收集細胞，再用適量DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細胞，轉(zhuǎn)移細胞懸液至兩個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞傳代3次后可用于實驗。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖能力：取對數(shù)生長期的細胞SMMC-7721，5×103/孔接種于4個96孔板，每孔培養(yǎng)液為200μl，預培養(yǎng)24h后進行實驗。每板按照分組加入含不同濃度冬凌草甲素的完全培養(yǎng)液，使其終濃度為空白組（0μmol/L）、低劑量組（8μmol/L）、中劑量組（16μmol/L）和高劑量組（32μmol/L），每組8個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)。分別再培養(yǎng)24、48、72、96h后終止培養(yǎng)。加MTT液(2㎎/ml)20ml/孔，再培養(yǎng)4h，離心棄上清液，加DMSO180μl/孔顯色。用酶標儀在波長570nm下讀取吸光度(OD)值。

1.3.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力：檢測不同濃度冬凌草甲素處理后對細胞SMMC-7721遷移能力的影響，取細胞對數(shù)生長期制備單細胞懸液，將2×105/ml細胞/孔接種于24孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10～12h后，在90%融合的單層細胞表面劃出一無細胞的細痕，用基礎培養(yǎng)液漂洗數(shù)次清洗劃痕道上的細胞。加入無血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察48h后細胞遷移到劃痕區(qū)的情況，采用ImageJ軟件計算遷移到劃痕區(qū)細胞的單位面積數(shù)值變化，每組設3個復孔。

1.3.4 WesternBlot法檢測E-鈣黏蛋白（E-cad）和波形蛋白（Vimentin）的表達水平：各組作用48小時后，蛋白裂解液裂解細胞后提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。丙烯酰胺凝膠垂直電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加一抗稀釋液4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液（PBST）洗膜10min×3次。加入不同稀釋比的二抗稀釋液室溫孵育1h，PBST緩沖液洗膜10min×3次。ECL化學發(fā)光，暗室膠片顯影后，Image-Pro Plus5.0軟件計算條帶光密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，方差齊性采用單因素方差分析，用LSD法進行組間兩兩比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對人肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響：見表1。

表1 冬凌草甲素對人肝癌 SMMC-7721細胞體外抑制OD值比較(±s)

表1 冬凌草甲素對人肝癌 SMMC-7721細胞體外抑制OD值比較(±s)

注：與空白組比較，*P＜0.01，與低劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

空白組低劑量組中劑量組高劑量組0.371±0.065 0.132±0.032*0.046±0.011*▲▲0.043±0.008*▲▲0.093±0.005 0.093±0.008 0.099±0.007 0.098±0.007 0.156±0.019 0.087±0.005*0.071±0.005*▲0.070±0.014*▲0.181±0.016 0.093±0.007*0.059±0.003*▲▲0.053±0.009*▲▲0.335±0.016 0.119±0.008*0.052±0.004*▲▲0.039±0.006*▲▲

2.2 各組細胞遷移能力比較：根據(jù)初步的細胞增殖實驗，確定冬凌草甲素作用48小時來進行實驗。結(jié)果見表2。

表2 冬凌草甲素對細胞SMMC-7721遷移能力的影響

2.3 各組E-cad和Vimentin的WesternBlot法檢測：見表3。

表3 冬凌草甲素對各組E-cad和Vimentin表達的灰度比值比較（±s）

表3 冬凌草甲素對各組E-cad和Vimentin表達的灰度比值比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與低劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

空白組低劑量組中劑量組高劑量組6 6 6 6 0.519±0.055 0.633±0.0156**0.718±0.048**▲▲0.756±0.027**▲▲0.711±0.051 0.627±0.046*0.544±0.061**▲0.538±0.073**▲

3 討論

冬凌草又名延命草，素有“人間仙草”的美稱，是唇形科香茶菜屬植物碎米亞椏的全草，發(fā)源于濟源太行、王屋山區(qū)?！吨腥A人民共和國藥典》記載，冬凌草，味甘苦，性微寒，具有清熱解毒、健胃活血、消炎止痛和抗腫瘤等功效。冬凌草甲素是其抗癌最主要的活性成分之一。既往研究表明，冬凌草甲素抗腫瘤機制包括抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，降低端粒酶活性，抑制腫瘤細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，對腫瘤細胞周期的影響等［2］。E-cad屬于鈣黏蛋白超家族，是最重要的細胞上皮表型，介導細胞之間的黏附，維持細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的穩(wěn)定[3]。研究表明，E-cad的異常表達與肝細胞癌浸潤、轉(zhuǎn)移有密切關系[4]，其不僅能促進肝癌細胞轉(zhuǎn)移，還能誘導肝癌細胞的干細胞化。研究還發(fā)現(xiàn)[5]，肝癌中Vimentin表達增高，且同uPA的表達呈正相關，可能在肝癌的浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本次研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖，抑制細胞遷移能力，并且呈劑量-時間依賴性，與之前的研究報道一致[6]。進一步的機制研究表明，冬凌草甲素可增強E-cad表達，下調(diào)Vimentin表達，且與劑量相關。實驗結(jié)果表明冬凌草甲素可抑制腫瘤上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化過程，從而抑制腫瘤增殖和遷移侵襲能力，為冬凌草應用于臨床提供了有力的理論及實驗依據(jù)。本課題組還將對冬凌草甲素其他抗腫瘤機制，做進一步的深入研究。