蒲澤錦， 李國平， 詹浩煉， 周小濤， 郭益添， 項(xiàng)夢(mèng)琦， 劉麗璇， 譚 輝， 吳靈飛△

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 2放射科， 廣東 汕頭 515041)

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs, lnc-RNAs)是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA家族。母系表達(dá)基因 3(maternal expressed gene 3, MEG3)是人體內(nèi)lncRNAs之一，定位于人染色體14q32.3，在表觀遺傳、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平等多方面調(diào)節(jié)細(xì)胞生理和病理過程[1-2]。MEG3活化后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在卵巢癌[3]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[4]、肺癌[5]和食管癌[6]等多種腫瘤組織呈現(xiàn)低表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展關(guān)系密切。

腺苷(adenosine)由腺嘌呤和核糖組成，參與機(jī)體內(nèi)ATP和第二信使cAMP的合成，對(duì)機(jī)體內(nèi)能量代謝和信息傳遞起著重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)腺苷參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)及衰老的調(diào)節(jié)，另外還參與細(xì)胞內(nèi)自噬調(diào)節(jié)[7-8]。自噬是指一些需降解的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器等胞漿成分被雙層膜包裹，運(yùn)送至溶酶體降解的過程[9-10]。自噬性降解產(chǎn)生的氨基酸和其它一些小分子物質(zhì)可被再利用或產(chǎn)生能量[9]?，F(xiàn)已明確，自噬的主要功能之一實(shí)際上是在細(xì)胞受到應(yīng)激性死亡威脅時(shí)保持細(xì)胞的存活，這是真核細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)、實(shí)現(xiàn)更新的一種重要的進(jìn)化保守機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)過多，自噬被過度激活的時(shí)候，細(xì)胞死亡就會(huì)通過線粒體中的前凋亡因子的誘導(dǎo)而發(fā)生(也稱之為自噬性死亡)[10]。多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)MEG3表達(dá)降低，肝癌細(xì)胞中MEG3也呈現(xiàn)低水平表達(dá)[11]。MEG3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的差異與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，揭示了其在細(xì)胞生長(zhǎng)周期中增殖、分化和死亡等多個(gè)進(jìn)程中的重要調(diào)控作用，為人類疾病的診斷及治療提供了新的靶點(diǎn)。既往研究已顯示出腺苷對(duì)肝癌細(xì)胞自噬具有調(diào)節(jié)作用；薈萃分析顯示MEG3已成為預(yù)示腫瘤預(yù)后的一個(gè)臨床生物學(xué)標(biāo)志[12-13]。不同濃度的腺苷對(duì)肝癌自噬的影響是否有差別性，增加肝癌細(xì)胞MEG3表達(dá)對(duì)腺苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的影響未見報(bào)道。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；腺苷、MDC和LC3B兔多抗購自Sigma；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)兔單抗購自CST；β-tubulin鼠單抗購自Abcam；山羊抗兔IgG(H+L)和山羊抗小鼠IgG(H+L)購自Jackson；CCK-8試劑盒購自日本同仁；MEG3慢病毒購自上海生工。生物正置熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS；Countess II全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自Invitrogen。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，加入1 mmol/L腺苷處理，為腺苷組，加入相同體積的DMSO作為對(duì)照組，培養(yǎng)12 h。取對(duì)照組和腺苷組細(xì)胞并按每孔2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)量接種于6孔板，分別在這2組中各選2孔并按MOI=100加入包裝后的MEG3慢病毒,即分別為MEG3組和MEG3+腺苷組。以上4組細(xì)胞均繼續(xù)在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2.2Western blot檢測(cè)LC3和mTOR蛋白的表達(dá) 將對(duì)照組、MEG3組、腺苷組和MEG3+腺苷組的HepG2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔24 h更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，72 h后收集細(xì)胞。PBS洗滌2次，吸去PBS，每管加入100 μL的RIPA，重懸細(xì)胞，冰浴30 min后裂解細(xì)胞。4 ℃、13 000 r/min離心30 min，測(cè)定總蛋白濃度。配制5%的濃縮膠和8%或12%的分離膠，按每孔10 μg總蛋白量上樣，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用3% BSA-TBST封閉，1∶2 000稀釋LC3B兔多抗、mTOR兔單抗和β-tubulin鼠單抗等 I 抗在4 ℃搖晃孵育過夜，TBST洗膜，山羊抗兔/小鼠IgG(H+L)-HRP的II 抗孵育，TBST洗膜后ECL發(fā)光，膠片曝光，顯影及定影。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3MDC染色檢測(cè)自噬體 將對(duì)照組、MEG3組、腺苷組和MEG3+腺苷組的HepG2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔24 h更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，72 h后收集細(xì)胞。每孔加入500 μL(濃度為30 μmol/L)的MDC工作液，37 ℃避光孵育30 min。PBS漂洗，取載玻片并滴加少量抗熒光猝滅劑，將細(xì)胞爬片后倒扣于載玻片上，熒光顯微鏡觀察拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4CCK-8法和活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)腺苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 將對(duì)照組、MEG3組、腺苷組和MEG3+腺苷組的HepG2細(xì)胞分別接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。選擇檢測(cè)時(shí)點(diǎn)為0、12、24、48和72 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，加入1 mmol/L腺苷處理(腺苷組)，加入相同體積的DMSO作為對(duì)照(對(duì)照組)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。取對(duì)照組和腺苷處理組細(xì)胞并按每孔1×104個(gè)細(xì)胞數(shù)量接種于24孔板，分別在這2組中各選6孔并按MOI=100加入包裝后的MEG3慢病毒(分別為MEG3組和MEG3+腺苷組)。以上4組在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。選擇檢測(cè)時(shí)點(diǎn)為0、12、24、48、72 h，胰酶消化細(xì)胞后加入含10% FBS的DMEM中和胰酶，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入1 mL含10% FBS的DMEM重懸細(xì)胞，吸取10 μL加入計(jì)數(shù)板中，使用Countess II全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，每2組間均數(shù)比較采用Bonfferoni’st檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過表達(dá)的MEG3對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組比較，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MEG3組中HepG2細(xì)胞內(nèi)的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低(P<0.05),見圖1。MDC染色顯示MEG3組中HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬體較對(duì)照組輕微減少，細(xì)胞漿和細(xì)胞核周圍均可見自噬體，見圖2。

2 腺苷對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組比較，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腺苷組中HepG2細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P<0.05);與MEG3組比較，腺苷組中HepG2細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均輕微降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖1。MDC染色顯示腺苷組中HepG2細(xì)胞核周圍及細(xì)胞漿中自噬體較對(duì)照組和MEG3組減少，見圖2。

3 過表達(dá)的MEG3對(duì)腺苷誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組、MEG3組和腺苷組比較，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MEG3+腺苷組中HepG2細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)被明顯抑制，僅可見極少量LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.01)，見圖1。MDC染色顯示MEG3+腺苷組中自噬體減少最為明顯，自噬體主要位于細(xì)胞核周圍，細(xì)胞漿中僅見散在自噬顆粒，見圖2。

4 MEG3和腺苷作用于HepG2細(xì)胞后mTOR 的變化

為驗(yàn)證mTOR是否參與MEG3和腺苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)過程，我們采用Western blot檢測(cè)mTOR蛋白水平的變化,結(jié)果顯示MEG3組和腺苷組中HepG2細(xì)胞內(nèi)mTOR表達(dá)較對(duì)照組增加(P<0.05)；MEG3+腺苷組中HepG2細(xì)胞內(nèi)mTOR表達(dá)較腺苷組和MEG3組均進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 1. The autophagy of HepG2 cells was inhibited by MEG3 and adenosine. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMEG3 or adenosine group.

圖1MEG3和腺苷抑制了HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬

Figure 2. The numbers of autophagosomes in HepG2 cells were reduced after treated with MEG3 and adenosine.

圖2MEG3和腺苷減少了HepG2內(nèi)自噬體數(shù)量

Figure 3. The expression of mTOR in HepG2 cells was increased after treated with MEG3 and adenosine. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMEG3 or adenosine group.

圖3MEG3和腺苷促進(jìn)HepG2細(xì)胞mTOR的表達(dá)

5 MEG3和腺苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

為驗(yàn)證MEG3和腺苷是否影響HepG2細(xì)胞的增殖，實(shí)驗(yàn)中采用CCK-8法和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)，結(jié)果顯示處理HepG2細(xì)胞24～72 h，MEG3組和腺苷組存活的HepG2細(xì)胞數(shù)量減少，較對(duì)照組有明顯差異(P<0.01)，HepG2細(xì)胞的活力降低；在48～72 h可觀察到腺苷組中存活的HepG2細(xì)胞數(shù)均少于MEG3組(P<0.01)。MEG3+腺苷組存活的HepG2細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與對(duì)照組、MEG3組和腺苷組相比有明顯差異(P<0.01)，細(xì)胞活力較對(duì)照組、MEG3組和腺苷組更加降低，見圖4、表1。

Figure 4. The viability of HepG2 cells was reduced by MEG3 and adenosine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMEG3 or adenosine group.

圖4MEG3和腺苷抑制HepG2細(xì)胞的活力

表1 MEG3和腺苷減少HepG2活細(xì)胞數(shù)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMEG3 or adenosine group.

討 論

肝癌在全世界范圍內(nèi)為最常見腫瘤之一，具有極高死亡率，發(fā)病后生存期短[13]。由于早期無癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)間晚，肝癌患者能獲得的手術(shù)機(jī)會(huì)少，因此化學(xué)藥物治療仍是目前保守治療的主要手段。目前化療藥物或因毒性大，或肝癌細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，影響了化療藥物對(duì)肝癌的治療效果，迄今為止，已有的化療藥物和方案效果均不理想。研究有效和毒副作用小的抗肝癌藥物，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性成為研究者面對(duì)的一個(gè)難題。

腺苷是參與體內(nèi)核苷酸代謝的物質(zhì)。既往我們的研究顯示較高濃度腺苷(4 mmol/L)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)阻滯細(xì)胞周期，表明腺苷可以作為一種抗肝癌的藥物[7]。在本研究中，我們適當(dāng)降低腺苷的濃度至1 mmol/L，發(fā)現(xiàn)腺苷仍能有效減少肝癌細(xì)胞活力，抑制肝癌細(xì)胞增殖，降低肝癌細(xì)胞的生存能力。受到應(yīng)激性死亡威脅時(shí)保持細(xì)胞的存活，這是細(xì)胞內(nèi)自噬的主要功能之一。腺苷作用于肝癌細(xì)胞后自噬是否發(fā)生改變引起了我們的興趣。已有研究顯示，用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤抑制自噬可促進(jìn)抗腫瘤藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制[14]。在本研究中，以較低濃度的腺苷處理肝癌細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)明顯減弱，同時(shí)細(xì)胞的增殖和活力均降低，提示腺苷也可以通過影響肝癌細(xì)胞自噬而發(fā)揮抗癌作用。

MEG3屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNAs家族成員，多種腫瘤中低水平表達(dá)的MEG3與腫瘤細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和預(yù)后密切相關(guān)，為腫瘤的預(yù)警標(biāo)志物和病人預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)之一，提示MEG3也可成為腫瘤治療的靶標(biāo)之一[5, 13]。MEG3過表達(dá)已經(jīng)顯示出具有抑制結(jié)直腸癌[5]和卵巢癌[3]等腫瘤細(xì)胞增殖的作用，并且發(fā)現(xiàn)MEG3能抑制自噬而促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[15]。肝癌細(xì)胞內(nèi)MEG3表達(dá)減少[11]，這可能是肝癌細(xì)胞生存所需的條件之一。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MEG3過表達(dá)后同樣可引起肝癌細(xì)胞活力下降，抑制肝癌細(xì)胞增殖，降低肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬等結(jié)果。MEG3是否影響腺苷的抗肝癌效果，目前尚無明確提示。實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合運(yùn)用MEG3和較低濃度腺苷處理肝癌細(xì)胞，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞增殖和活力明顯降低，效果均強(qiáng)于單用腺苷或MEG3，同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬被明顯抑制。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)腺苷在降低肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬和抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力略強(qiáng)于MEG3，因此我們認(rèn)為，自噬是腺苷發(fā)揮抗肝癌作用的環(huán)節(jié)之一，MEG3也能通過降低肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬而協(xié)同腺苷發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。

mTOR屬于絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖、抑制細(xì)胞自噬的功能，調(diào)節(jié)mTOR通路可影響細(xì)胞凋亡和自噬[10, 16]，本研究發(fā)現(xiàn)在較低濃度腺苷和MEG3分別處理后，肝癌細(xì)胞內(nèi)mTOR表達(dá)增多，自噬降低，聯(lián)合MEG3和腺苷處理后引起自噬進(jìn)一步降低，細(xì)胞內(nèi)mTOR表達(dá)增多尤為明顯，mTOR表達(dá)增多與自噬降低相一致，表明mTOR參與MEG3和腺苷降低肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程。

總之，我們的研究結(jié)果提示，抗腫瘤藥物腺苷在較低濃度下抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和降低肝癌細(xì)胞的活力，MEG3通過調(diào)節(jié)mTOR通路而加強(qiáng)了腺苷對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)的抑制，增強(qiáng)了腺苷治療肝癌的效果。MEG3的作用研究任重而道遠(yuǎn)，聯(lián)合運(yùn)用MEG3和腺苷對(duì)未來肝癌治療的化療藥物研究有實(shí)用價(jià)值。

致謝：本研究在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，在此致以由衷的感謝！