藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究進(jìn)展與展望

王立娜，王家林，朱濤，呂雪峰

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藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究進(jìn)展與展望

王立娜1,2，王家林1，朱濤2，呂雪峰2

1 青島科技大學(xué) 海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042 2 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

王立娜, 王家林, 朱濤, 等. 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究進(jìn)展與展望. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34 (9): 1386–1397.Wang LN, Wang JL, Zhu T, et al. Progress and perspectives on cyanobacterial ploidy. Chin J Biotech, 2018, 34 (9): 1386–1397.

藍(lán)細(xì)菌是一類古老的光合原核微生物。就基因組拷貝數(shù) (倍性) 而言，藍(lán)細(xì)菌是原核生物中基因組低、中、高拷貝共存的典型類群之一，而基因組多拷貝特性是制約藍(lán)細(xì)菌高效遺傳改造的瓶頸。已有研究表明，藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)表現(xiàn)出生長(zhǎng)周期的依賴性并受多種遺傳、環(huán)境因子的影響。文中綜述了藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展、分析方法及影響因素，并討論了藍(lán)細(xì)菌基因組多拷貝研究的環(huán)境生態(tài)和生物技術(shù)意義。最后，對(duì)未來(lái)藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)相關(guān)的研究方向作出展望。

藍(lán)細(xì)菌，基因組拷貝數(shù)，理化因子，細(xì)胞工廠

生物基因組的拷貝數(shù)，在真核生物中稱之為倍性 (Ploidy)，指細(xì)胞核中所含有的染色體組 () 的套數(shù)。正常的配子細(xì)胞中所包含的染色體數(shù)稱為一套單倍染色體 (單倍體，Haploid)，用符號(hào)表示。具有兩個(gè)染色體組的細(xì)胞或個(gè)體稱為二倍體 (2，Diploid)，具有兩個(gè)以上整套染色體組的細(xì)胞或個(gè)體則稱為多倍體 (Polyploid)，包括三倍體 (3，Triploid)、四倍體 (4，Tetraploid) 等。

在自然界中，許多真核生物如纖毛蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物、魚(yú)類、開(kāi)花植物等，都是多倍體生物[1]。受早期大腸桿菌 (，革蘭氏陰性菌)[2]和枯草芽胞桿菌 (，革蘭氏陽(yáng)性菌)[3]等模式生物相關(guān)研究的影響，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為原核生物僅有一個(gè)基因組拷貝，其基因組單拷貝特征在文獻(xiàn)中也稱之為單倍性 (Monoploidy)[1]。但是，近年來(lái)對(duì)細(xì)菌最大的類群——變形菌門 (Proteobacteria) 的分析發(fā)現(xiàn)，涵蓋其α-、β-、γ-、δ-、ε-變形桿菌綱的多數(shù)菌株并非只擁有單個(gè)拷貝的基因組[4]。大腸桿菌 (γ-變形桿菌綱) 在最優(yōu)培養(yǎng)條件下快速生長(zhǎng)時(shí)，其胞內(nèi)也可含有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。這里需要指出的是，原核生物的基因組多拷貝現(xiàn)象，在許多文獻(xiàn)中也稱之為“多倍性” (Polyploidy)，但是此處的Polyploidy是與原核生物的寡倍性 (Oligoploidy，數(shù)個(gè)基因組拷貝)、單倍性 (Monoploidy，單個(gè)基因組拷貝) 相呼應(yīng)的概念，與真核生物的多倍性所表達(dá)的生物學(xué)意義并不相同。通常中文表述中所指的原核生物的倍性即細(xì)胞所含有的基因組DNA的拷貝數(shù)。

原核生物界還有另外一個(gè)大的類群叫作藍(lán)細(xì)菌 (Cyanobacteria)，其細(xì)胞壁具有革蘭氏陰性菌特征，由內(nèi)外兩層構(gòu)成，外層為外膜，由外側(cè)的脂多糖層和內(nèi)側(cè)的磷脂層構(gòu)成，內(nèi)層為肽聚糖，許多藍(lán)細(xì)菌還可分泌膠狀物質(zhì)，在細(xì)胞群體或絲狀體外形成膠被。藍(lán)細(xì)菌的膜系統(tǒng)包括細(xì)胞膜和類囊體膜，細(xì)胞膜包裹細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有平行或卷曲方式分布的類囊體膜結(jié)構(gòu)，是光合作用發(fā)生的場(chǎng)所。與其他原核生物類似，藍(lán)細(xì)菌缺乏其他膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，沒(méi)有真正意義的細(xì)胞核、線粒體等[5-6]。藍(lán)細(xì)菌既是研究光合作用、碳氮固定、葉綠體進(jìn)化等基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題的優(yōu)良模式生物，又是合成新型生物燃料和化學(xué)品的重要底盤細(xì)胞[7-10]。多年來(lái)，原核生物基因組多拷貝現(xiàn)象未能引起足夠的重視，而最近的研究表明藍(lán)細(xì)菌是原核生物中基因組低、中、高拷貝共存的典型類群之一[1]。

基因組多拷貝現(xiàn)象可能涉及多個(gè)胞內(nèi)過(guò)程，有其潛在優(yōu)勢(shì)，如全局調(diào)控基因表達(dá)、控制細(xì)胞體積、調(diào)節(jié)基因劑量、減少自發(fā)突變、輔助DNA修復(fù)等[1,11]，并且有報(bào)道指出藍(lán)細(xì)菌的基因組DNA表現(xiàn)出依賴于晝夜節(jié)律的時(shí)空分布特征[12-13]。

然而，就生物技術(shù)應(yīng)用而言，基因組多拷貝則可能是制約藍(lán)細(xì)菌高效遺傳改造的潛在障礙[14]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)與細(xì)胞生長(zhǎng)周期及多種理化因子相關(guān)[11]。從根本上認(rèn)識(shí)藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)特征并發(fā)掘其可能的影響和控制因素，還面臨著巨大的挑戰(zhàn)。而以藍(lán)細(xì)菌作為研究模式解析原核生物基因組多拷貝現(xiàn)象的形成機(jī)制仍具有較為廣闊的研究空間。

本文對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的相關(guān)研究進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，將有助于在全局水平上認(rèn)識(shí)藍(lán)細(xì)菌基因組的多拷貝現(xiàn)象，優(yōu)化依賴標(biāo)簽基因頻率對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)體系，加速推動(dòng)以藍(lán)細(xì)菌作為“細(xì)胞工廠”合成生物能源和高附加值化學(xué)品的進(jìn)程。

1 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的相關(guān)研究

1.1 藍(lán)細(xì)菌是基因組低、中、高拷貝共存的代表性原核微生物之一

早在20世紀(jì)六、七十年代，Marvin Edelman、Rosmarie Rippka等學(xué)者就對(duì)巴斯德菌種保藏中心 (Pasteur Culture Collection，PCC) 的200多株藍(lán)細(xì)菌的基因組大小進(jìn)行系統(tǒng)研究[15-17]。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多藍(lán)細(xì)菌的基因組被測(cè)序分析，這使得對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組大小的整體認(rèn)識(shí)變得更為全面精確[10,18]。相對(duì)而言，關(guān)于藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究卻比較匱乏?，F(xiàn)對(duì)目前已報(bào)道的關(guān)于藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝的相關(guān)研究總結(jié)于表1。

其中聚球藻sp. WH 7805和sp. WH 8101為目前已鑒定的基因組單拷貝菌株，其余菌株的基因組均為多拷貝。細(xì)長(zhǎng)聚球藻和sp. PCC 6301的基因組拷貝數(shù)在2?6之間，有報(bào)道稱集胞藻sp. PCC 6803等菌株的基因組拷貝數(shù)可達(dá)幾十甚至上百，而實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的紅海束毛藻IMS101平均每個(gè)細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)最高可達(dá)600多個(gè)拷貝。因此，藍(lán)細(xì)菌是基因組低、中、高拷貝共存的代表性的原核微生物類群之一。

表1 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)及相關(guān)分析參數(shù)[1]

aStationary phase;bLight-dark cycles;cExponential phase/linear phase/stationary phase;dLonger doubling times correspond to lower genome copy numbers;eCalculated from relative fluorescence and genome size of PCC 6301;fField-collected samples.

1.2 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究方法

早期對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的關(guān)注主要是為了認(rèn)識(shí)其細(xì)胞分裂過(guò)程和特性，而后隨著分子生物學(xué)的興起，科學(xué)家開(kāi)始發(fā)掘和改造模式藍(lán)細(xì)菌，并藉此探索光合作用、碳氮代謝和細(xì)胞分化等基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題。而基因組多拷貝時(shí)常導(dǎo)致一些基因不能被完全敲除，因此為深入認(rèn)識(shí)藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)特性，各種分析方法應(yīng)運(yùn)而生。近年來(lái)，代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，發(fā)展藍(lán)細(xì)菌光合“細(xì)胞工廠”，合成生物能源和高附加值化合物，精確分析其基因組復(fù)制過(guò)程和基因組拷貝數(shù)特性，則是整體提高其遺傳改造效率的必然選擇。藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究方法分述如下并總結(jié)于表2。

1.2.1 分光光度法 (Spectrophotometry)

分光光度法是較為簡(jiǎn)單易行的分析原核生物基因組拷貝數(shù)的方法。該方法的基本原理是提取一定數(shù)量細(xì)胞的基因組DNA，利用分光光度法 (260 nm波長(zhǎng)處的吸收峰) 對(duì)其定量 (m)，并計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量 (M)，結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)，可推算單位細(xì)胞的基因組拷貝數(shù) (N=NA*m/M，N為菌株基因組拷貝數(shù)，NA為阿伏伽德羅常數(shù))[1,4]。分光光度法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)設(shè)備要求低，數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是因涉及DNA提取，因此分析通量低，要求基因組純度高、提取損失率小，且要排除RNA和內(nèi)源質(zhì)粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。

德國(guó)法蘭克福大學(xué)J?rg Soppa教授實(shí)驗(yàn)室曾以分光光度法證實(shí)細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942和聚球藻WH 7803的基因組拷貝數(shù)與早期用其他方法所得結(jié)果一致，但集胞藻PCC 6803的基因組拷貝數(shù)可高達(dá)218，與前人的報(bào)道相差較大[1]。后來(lái)該實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)分析了集胞藻PCC 6803的6株亞株的基因組拷貝數(shù)，分光光度法所得結(jié)果與前述其實(shí)驗(yàn)室報(bào)道結(jié)果仍有較大差異[11]。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分析法 (Flow cytometry)

流式細(xì)胞儀分析法可以與DNA熒光染色結(jié)合，對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行高通量、多參數(shù)的定性定量分析。該方法首先需要確定一個(gè)合適的對(duì)照菌株 (如經(jīng)抑制劑處理后細(xì)胞處于基因組單拷貝狀態(tài)的大腸桿菌)，經(jīng)過(guò)熒光補(bǔ)償后，根據(jù)前向散射 (FSC)、側(cè)向散射 (SSC) 等參數(shù)，得到基因組單拷貝大腸桿菌的熒光強(qiáng)度值。再將目的菌株的基因組DNA染色、進(jìn)樣分析，根據(jù)目的菌株熒光強(qiáng)度值與大腸桿菌單拷貝熒光強(qiáng)度值對(duì)比，計(jì)算獲得目的菌株基因組拷貝數(shù)[30]。

目前關(guān)于藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究結(jié)果多數(shù)來(lái)自流式細(xì)胞分析法。20世紀(jì)90年代，麻省理工學(xué)院Sallie W. Chisholm教授實(shí)驗(yàn)室在研究聚球藻PCC 6301胞內(nèi)基因組DNA復(fù)制循環(huán)與細(xì)胞生長(zhǎng)速率關(guān)系時(shí)，就以此方法證實(shí)該菌株的基因組拷貝數(shù)為2?6[25]。此后，該實(shí)驗(yàn)室還以流式細(xì)胞法系統(tǒng)分析了4株海洋菌株的基因組拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)聚球藻WH 8101和聚球藻WH 7805為單拷貝，聚球藻WH 8103為1?2拷貝，聚球藻WH 7803為2?4拷貝[26]。日本東京農(nóng)業(yè)大學(xué)Hirofumi Yoshikawa教授實(shí)驗(yàn)室建立了基于流式細(xì)胞分析的精確的藍(lán)細(xì)菌基因組DNA拷貝數(shù)的分析方法，并比較了細(xì)長(zhǎng)聚球藻 PCC 7942光照和黑暗條件下流式細(xì)胞儀分析信號(hào)的顯著差別和基因組拷貝數(shù)的差異[30]。

1.2.3 熒光定量PCR法 (qPCR)

qPCR技術(shù)分析菌株基因組拷貝數(shù)的流程是：提取待分析菌株的完整基因組DNA，并選取1 kb左右的標(biāo)準(zhǔn)片段進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。以已知濃度的PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行一系列濃度梯度稀釋后，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，并據(jù)其產(chǎn)物濃度和擴(kuò)增特性制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，以待分析菌株基因組DNA作為模板進(jìn)行濃度梯度稀釋，再進(jìn)行qPCR反應(yīng)以擴(kuò)增其內(nèi)部300 bp左右的內(nèi)參序列，所得t值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合菌株細(xì)胞數(shù)目即可獲得該菌株的平均基因組拷貝數(shù)[1,4]。

qPCR技術(shù)是較為靈敏的測(cè)定藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的技術(shù)，為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，該方法對(duì)目標(biāo)菌株基因組DNA的要求較高，需要提取方法損失小、DNA完整無(wú)斷裂且純度較高。如前述分光光度法，J?rg Soppa實(shí)驗(yàn)室還以qPCR分析了各個(gè)菌株的基因組拷貝數(shù)，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明qPCR法和分光光度法所得數(shù)據(jù)近似[1,11]。此外，Sargent等以單拷貝固氮基因作為標(biāo)準(zhǔn)片段，以qPCR法作為分析方法，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)紅海束毛藻的基因組拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于海洋環(huán)境樣品中同屬的其他菌株[29]。

1.2.4 熒光蛋白分子顯示系統(tǒng) (Fluorescent reporter-operator system, FROS)

熒光蛋白標(biāo)記結(jié)合顯微成像技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的可以實(shí)時(shí)追蹤分析微生物基因組復(fù)制、分配動(dòng)態(tài)和基因組拷貝數(shù)的方法。該方法的基本原理是基于順式作用元件和反式作用因子的結(jié)合，在目標(biāo)物種基因組上插入、等的上百個(gè)串聯(lián)重復(fù) (中間以10 bp左右的隨機(jī)序列隔開(kāi)以減少同源重組)，并在目標(biāo)物種胞內(nèi)表達(dá)熒光蛋白標(biāo)記 (GFP、YFP等) 的LacI、TetR，在加入誘導(dǎo)劑的情況下，可標(biāo)記目標(biāo)物種的單個(gè)基因組的特定位置，并可實(shí)時(shí)分析其動(dòng)態(tài)變化[31]。

熒光蛋白分子顯示系統(tǒng) (如LacO240/LacI- fluorescent protein tag、TetO240/TetR-fluorescent protein tag等) 用于分析基因組拷貝數(shù)具有極高的準(zhǔn)確性，可同時(shí)標(biāo)記基因組的復(fù)制起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，因此還用于分析基因組DNA分子內(nèi)和分子間的動(dòng)態(tài)變化特征[32-33]。該方法的缺點(diǎn)是在基因組上引入了數(shù)百個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，可能會(huì)擾亂DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，降低菌株的遺傳穩(wěn)定性，因此僅用于分析模式菌株[32-34]。

表2 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的研究方法

霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的Erin K. O’Shea教授實(shí)驗(yàn)室[32]和哈佛大學(xué)的Pamela A. Silver教授實(shí)驗(yàn)室[33]曾分別采用熒光蛋白分子顯示系統(tǒng)分析了細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942的基因組拷貝數(shù)及其復(fù)制和分配特性，發(fā)現(xiàn)該菌株可含有4?6個(gè)基因組拷貝，其基因組復(fù)制不依賴于細(xì)胞分裂，具有非同步復(fù)制、嚴(yán)謹(jǐn)型分配的特點(diǎn)。

1.2.5 熒光原位雜交法 (Fluorescenthybridization, FISH)

熒光原位雜交法的原理是：將熒光素標(biāo)記探針與待檢測(cè)菌株基因組DNA上特定片段雜交，經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。再利用熒光素與特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，可借助熒光檢測(cè)體系在熒光顯微鏡下對(duì)目標(biāo)物種基因組DNA進(jìn)行定性、定量、定位分析。

FISH技術(shù)分析藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、不涉及復(fù)雜的遺傳操作，可與流式細(xì)胞法相結(jié)合。與FROS技術(shù)相比，其缺點(diǎn)是涉及固定過(guò)程，不能進(jìn)行活體標(biāo)記。

最近，Hirofumi Yoshikawa 實(shí)驗(yàn)室以FISH技術(shù)標(biāo)記了細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942的基因組，較全面地分析了影響其遺傳分配的相關(guān)基因[34]。

綜上所述，因藍(lán)細(xì)菌種類豐富，是基因組低、中、高拷貝共存的典型類群，甚至同一株系的不同亞株間基因組拷貝數(shù)都有較大差異。因此，對(duì)于基因組拷貝數(shù)的分析，需要上述多種方法的結(jié)合，且要借助目標(biāo)菌株的其他生理生化指標(biāo)，才可獲得特定菌株基因組拷貝數(shù)的概貌。而對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)，也是分析其影響因素和調(diào)控機(jī)制的必要前提。

2 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的影響因素

藍(lán)細(xì)菌作為一類古老的光合原核微生物，在進(jìn)化過(guò)程中形成了低、中、高拷貝類群共存的格局，反映出其極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。原核生物的基因組多拷貝現(xiàn)象被認(rèn)為在真核生物有絲分裂、減數(shù)分裂以及真核生物性的起源中發(fā)揮了重要作用[35]?，F(xiàn)在已經(jīng)證明真核生物的細(xì)胞分裂由細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子所控制，與此不同，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞分裂中尚未發(fā)現(xiàn)類似的主控因子，因此，藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞分裂和遺傳物質(zhì)分配可能是一個(gè)多維度的復(fù)雜事件。

已有研究表明藍(lán)細(xì)菌的基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂是非同步的，高拷貝菌株集胞藻PCC 6803的基因組DNA的遺傳分配是非嚴(yán)謹(jǐn)型調(diào)控的，新生細(xì)胞和母代細(xì)胞所獲基因組的拷貝數(shù)具有一定的隨機(jī)性[36]。而細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942的基因組DNA沿其長(zhǎng)軸與羧酶體間隔排列的特征，則被認(rèn)為是完成其遺傳物質(zhì)嚴(yán)謹(jǐn)型分配的重要保障。藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)生較大變化，并且受多種環(huán)境因子和遺傳因子的影響，下面將分別介紹。

2.1 藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)表現(xiàn)出生長(zhǎng)周期 (Growth phase) 的依賴性

德國(guó)法蘭克福大學(xué)J?rg Soppa實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示集胞藻PCC 6803的基因組拷貝數(shù)是高度可變的，表現(xiàn)出生長(zhǎng)周期的依賴性，在接種初期 (750≈0.1) 其平均拷貝數(shù)均值約為20，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)其基因組拷貝數(shù)明顯降低，在平臺(tái)期 (750≈2.5) 均值約為4，前后相差4倍[11]。

細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942的基因組拷貝數(shù)也具有生長(zhǎng)周期依賴的特點(diǎn)，Hirofumi Yoshikawa實(shí)驗(yàn)室證實(shí)在生長(zhǎng)停滯期 (Lag phase) 其基因組DNA復(fù)制旺盛，基因組拷貝數(shù)高于指數(shù)生長(zhǎng)期和線性期[30]。藍(lán)細(xì)菌的整個(gè)生長(zhǎng)周期涉及多種理化因子的參與，因此，藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)在不同生長(zhǎng)階段表現(xiàn)出的巨大差別可能與此類理化因子相關(guān)。

2.2 影響藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的相關(guān)環(huán)境因子

2.2.1 光照強(qiáng)度

光照是藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)的必需條件，已有研究表明藍(lán)細(xì)菌的基因組DNA復(fù)制也是光依賴的。Hirofumi Yoshikawa教授實(shí)驗(yàn)室以細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942作為研究模式，深入解析了藍(lán)細(xì)菌基因組DNA復(fù)制的光依賴性。通過(guò)在野生型細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942中引入單純皰疹病毒來(lái)源的胸苷激酶 (Thymidine kinase, TK)，構(gòu)建了外加BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) 條件下可示蹤DNA從頭合成的PCC 7942TK菌株。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在黑暗條件下，DNA復(fù)制被阻斷，而在光照條件下，DNA復(fù)制重新開(kāi)始?；蚪MDNA復(fù)制能否正常起始，與胞內(nèi)基因組的拷貝數(shù)息息相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)室通過(guò)流式細(xì)胞分析證實(shí)細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942黑暗條件下的基因組拷貝數(shù)遠(yuǎn)小于光照[30]。

但是，J?rg Soppa教授團(tuán)隊(duì)對(duì)集胞藻PCC 6803的研究結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照條件 (80 μmol photon/(m2·s))，30 μmol photon/(m2·s)低光照強(qiáng)度下其拷貝數(shù)提高了接近2倍[11]。有證據(jù)顯示，光照會(huì)影響基因組DNA的胞內(nèi)空間排布，在黑暗狀態(tài)下，細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942的基因組DNA彌散于細(xì)胞質(zhì)中，在光暗循環(huán)或者持續(xù)光照條件下，其基因組DNA空間上呈現(xiàn)膨脹/壓縮交替的節(jié)律性變化[12-13]。光照引起的基因組DNA空間布局的節(jié)律性變化很可能是為即將進(jìn)行的細(xì)胞分裂及基因組各拷貝的遺傳分配做準(zhǔn)備。

此外，Yasuko Kaneko教授實(shí)驗(yàn)室還通過(guò)高壓低溫電子層析成像技術(shù)捕捉到了細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942處于高度壓縮狀態(tài)下的基因組DNA[37]。DNA復(fù)制的光依賴性可能跟光合電子傳遞有關(guān)。線性電子傳遞可阻斷DNA復(fù)制的起始和進(jìn)程，而圍繞光系統(tǒng)I的環(huán)式電子傳遞可推動(dòng)已起始復(fù)制的DNA完成復(fù)制過(guò)程[38]。光照強(qiáng)度對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的影響機(jī)制目前還不明確，有待深入解析。

2.2.2 磷元素

磷元素是DNA的重要組成部分，多個(gè)拷貝的基因組DNA的合成需要大量磷元素的參與。對(duì)集胞藻PCC 6803的研究結(jié)果顯示，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件 (0.13 mmol/L磷酸鹽)，高磷培養(yǎng)條件 (1.3 mmol/L磷酸鹽) 下，其平均基因組拷貝數(shù)可由27變成35，提高近1/3。而在缺磷培養(yǎng)基中，集胞藻PCC 6803的基因組拷貝數(shù)迅速降低，其生長(zhǎng)也受到一定程度的抑制，在培養(yǎng)6 d之后培養(yǎng)液光密度維持恒定，不再增加，但是其基因組拷貝數(shù)繼續(xù)降低，最終甚至可變成單拷貝[11]。J?rg Soppa實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，缺磷在導(dǎo)致集胞藻PCC 6803基因組拷貝數(shù)僅下降5倍的同時(shí)，其細(xì)胞數(shù)目增加了近20倍。

因此，缺磷條件下細(xì)胞短期內(nèi)的生長(zhǎng)能力與基因組拷貝數(shù)的降低幅度的差距，暗示缺磷培養(yǎng)前期，依然有基因組DNA從頭合成的進(jìn)行。而這一過(guò)程中磷元素的來(lái)源可能涉及胞內(nèi)的其他含磷組分，如多聚磷酸、RNA、ATP、NADP、磷脂等[11]。

Hirofumi Yoshikawa實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分析細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942培養(yǎng)液的元素消耗，證實(shí)磷元素在接種96 h后即被細(xì)胞吸收完畢，是消耗最快的大量元素。而這一時(shí)期胞內(nèi)基因組拷貝數(shù)快速增加[30]；此外，他們還分析了磷元素吸收相關(guān)的雙元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分 (和) 的轉(zhuǎn)錄情況，證實(shí)該系統(tǒng)在培養(yǎng)液磷元素含量較高的生長(zhǎng)延滯期不表達(dá)，而在胞外磷濃度降低85%后大量表達(dá)[30]。因此，磷元素也是影響細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942基因組拷貝數(shù)的重要因素。

2.2.3 DNA自身作為磷、碳、氮等的貯藏物

已有研究結(jié)果表明，基因組高拷貝古菌 (如沃氏富鹽菌) 的DNA除了充當(dāng)遺傳信息的載體外，富余的基因組DNA還可作為胞內(nèi)磷的貯藏體，在體內(nèi)磷元素匱乏時(shí)該古菌可降解其基因組DNA，從而維系細(xì)胞生長(zhǎng)。

J?rg Soppa實(shí)驗(yàn)室在集胞藻PCC 6803的研究發(fā)現(xiàn)，外源添加鯡魚(yú)精DNA可恢復(fù)缺磷引起的生長(zhǎng)抑制，暗示外源DNA添加可逆轉(zhuǎn)缺磷引起的基因組拷貝數(shù)的降低。另一有趣的現(xiàn)象是該實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)添加外源DNA還可恢復(fù)缺碳但不能恢復(fù)缺氮對(duì)集胞藻PCC 6803生長(zhǎng)的抑制[11]。

如前所述，海洋固氮藍(lán)細(xì)菌紅海束毛藻的基因組拷貝數(shù)可達(dá)數(shù)百個(gè)，其基因組大小約為7.75 Mb，顯著特點(diǎn)是40%左右的序列并不行使蛋白編碼功能，且10%左右的編碼基因?yàn)橹貜?fù)基因。Sargent等對(duì)紅海束毛藻的研究同樣認(rèn)為基因組DNA作為貯藏物可調(diào)節(jié)物種基因組拷貝數(shù)，提高物種的生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)能力[29]。無(wú)論自身DNA還是外源添加DNA對(duì)某一物種基因組拷貝數(shù)的影響，可能涉及DNA吸收、降解、碳氮代謝等一系列復(fù)雜的過(guò)程。在許多野外環(huán)境中，DNA結(jié)合態(tài)磷的濃度要遠(yuǎn)高于游離無(wú)機(jī)磷酸的濃度，也從側(cè)面說(shuō)明了DNA作為磷貯藏體的可能性[11]。

2.3 影響藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的相關(guān)遺傳因子

在大腸桿菌.、枯草芽胞桿菌、新月丙桿菌和天藍(lán)色鏈霉菌等模式生物中，已經(jīng)鑒定了維系類核結(jié)構(gòu)、基因組DNA遺傳分配、細(xì)胞分裂Z環(huán)形成等相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵基因，此類基因與他們新生細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)密切相關(guān)[39]。近年來(lái)，對(duì)藍(lán)細(xì)菌相關(guān)基因和作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)也取得了一定進(jìn)展?？赡苡绊懰{(lán)細(xì)菌基因組DNA遺傳分配和拷貝數(shù)的相關(guān)遺傳因子總結(jié)于表3，分述如下。

2.3.1 ParA對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組DNA遺傳分配的影響

ParA/MinD是微生物調(diào)節(jié)胞內(nèi)組分 (如質(zhì)粒、類核、細(xì)胞分裂相關(guān)因子等) 空間排布的一類ATP酶[32,34]。細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942中羧酶體和類核有沿長(zhǎng)軸交替線性排列的特點(diǎn)，而ParA被證實(shí)影響羧酶體的空間排布，因此，ParA參與了細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942的胞內(nèi)區(qū)間化調(diào)節(jié)[40]。

依賴FROS報(bào)告系統(tǒng)，Erin K. O’Shea實(shí)驗(yàn)室曾認(rèn)為敲除不影響基因組DNA的空間排布[33]。而最近Hirofumi Yoshikawa實(shí)驗(yàn)室對(duì)進(jìn)行了敲除、互補(bǔ)、過(guò)量表達(dá)等一系列遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，以熒光原位雜交技術(shù) (FISH) 證實(shí)參與了細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942基因組DNA的遺傳分配[34]。并通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，鑒定了與ParA互作的多個(gè)蛋白，其中3個(gè)蛋白 (Synpcc7942_2009, Synpcc 7942_2653和Synpcc7942_2045) 屬于SMC (Structural maintenance of chromosomes) 家族[34]。這些蛋白可能涉及基因組DNA的膨脹/壓縮特性，ParA對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942基因組DNA遺傳分配的作用機(jī)制可能與其相關(guān)。

2.3.2 MreB對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組DNA遺傳分配的影響

MreB是肌動(dòng)蛋白類似物，在細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)和基因組DNA遺傳分配中發(fā)揮重要作用。趙進(jìn)東教授實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥藻sp. PCC 7120的可被完全敲除，且僅影響細(xì)胞形態(tài)并不影響其基因組DNA的遺傳分配，魚(yú)腥藻PCC 7120的基因組DNA的遺傳分配方式可能是非嚴(yán)謹(jǐn)型調(diào)控的[22]。而細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942中僅能部分敲除，其突變株表現(xiàn)出基因組DNA的聚集現(xiàn)象，說(shuō)明MreB影響了該菌株基因組DNA的遺傳分配[32,34]。

大腸桿菌和霍亂弧菌的敲除會(huì)導(dǎo)致“無(wú)核”細(xì)胞的產(chǎn)生，但是細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942中無(wú)此現(xiàn)象。因此，MreB對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942基因組DNA遺傳分配的影響也可能是其影響細(xì)胞壁合成帶來(lái)的次級(jí)效應(yīng)。

藍(lán)細(xì)菌基因組DNA的復(fù)制、組織和分配是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)維系其基因組拷貝數(shù)至關(guān)重要。目前僅發(fā)現(xiàn)了少數(shù)影響藍(lán)細(xì)菌基因組遺傳分配的基因，且其作用機(jī)制還不清晰。但是當(dāng)前研究進(jìn)展證實(shí)，至少部分藍(lán)細(xì)菌基因組DNA的分配是受特定遺傳因子控制的，這為未來(lái)深入解析研究藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)特征奠定了基礎(chǔ)。

表3 模式細(xì)菌中細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白的分布

aBased on sequence alignment, no functional validation has been performed;bIt may involve mycelial growth rather than cell division.

3 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)相關(guān)研究的環(huán)境生態(tài)學(xué)和生物技術(shù)意義

3.1 環(huán)境生態(tài)學(xué)意義

以標(biāo)簽基因 (如16S rRNA基因、基因、基因、基因等) 結(jié)合高通量測(cè)序分析環(huán)境樣品的微生物組成、結(jié)構(gòu)和多樣性克服了早期基于形態(tài)和培養(yǎng)方法的局限，推動(dòng)了分子生態(tài)學(xué)的快速發(fā)展。當(dāng)然，標(biāo)簽基因頻率對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的映射也存在諸多的影響因素，如環(huán)境樣品DNA提取效率、PCR擴(kuò)增效率、標(biāo)簽基因多拷貝異質(zhì)性、數(shù)據(jù)分析方法等，針對(duì)上述潛在影響因素業(yè)已發(fā)展出多種應(yīng)對(duì)措施，在此不作贅述。

本文需要指出的是，環(huán)境樣品中特定物種的基因組多拷貝現(xiàn)象也是影響微生物群落結(jié)構(gòu)分析的重要因素。如Soppa教授所述，當(dāng)同一群落中基因組單拷貝和多拷貝的物種共存時(shí)，以標(biāo)簽基因頻率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的物種多樣性分析，會(huì)大大高估基因組多拷貝物種的豐度[46]。因此，在水華、赤潮等藍(lán)細(xì)菌相關(guān)的環(huán)境生態(tài)學(xué)研究中，菌株基因組拷貝數(shù)是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題，雖然當(dāng)前還不能依賴傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)環(huán)境樣品中各物種基因組拷貝數(shù)作出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，伴隨對(duì)特定生境中特色物種基因組拷貝數(shù)的深入認(rèn)識(shí)，結(jié)合生物信息學(xué)手段直接預(yù)測(cè)環(huán)境樣本中不同物種的基因組拷貝數(shù)在不久的未來(lái)將會(huì)實(shí)現(xiàn)。

3.2 生物技術(shù)意義

開(kāi)發(fā)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠，發(fā)掘其光合固碳效率和生物合成潛力，需要從本質(zhì)上認(rèn)識(shí)藍(lán)細(xì)菌的生命過(guò)程。在細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面，藍(lán)細(xì)菌雖是原核生物，卻有著高度協(xié)調(diào)的胞內(nèi)時(shí)空組織性[12,32-33,37,45]。而要獲得性狀穩(wěn)定的基因工程菌株，直接改造其基因組DNA是最佳選擇。具有天然遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是藍(lán)細(xì)菌作為光合細(xì)胞工廠的優(yōu)勢(shì)，但是伴隨漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程所獲得的基因組多拷貝特性，卻是高效遺傳改造藍(lán)細(xì)菌的障礙。較為矛盾的是，一旦目標(biāo)合成途徑被穩(wěn)定整合到各基因組拷貝上，為提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，其合成途徑的高效表達(dá)時(shí)常又依賴于基因組DNA劑量的增加。

因此，理想的遺傳改造過(guò)程是，在外源途徑引入時(shí)盡可能降低宿主細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)以提高同源重組和整合效率，在規(guī)模化培養(yǎng)基因工程菌株、表達(dá)外源途徑時(shí)盡可能提高基因組拷貝數(shù)以提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。而這一過(guò)程的實(shí)現(xiàn)，最首要的是鑒定能夠控制基因組拷貝數(shù)的遺傳和環(huán)境因子，并在基因組拷貝數(shù)可控條件下發(fā)掘提高同源重組效率的方法。如前所述，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)遺傳和環(huán)境因素影響藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)[11,34]，暗示前述基于基因組拷貝數(shù)遺傳改造和擴(kuò)大培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌的可行性。因此，認(rèn)識(shí)藍(lán)細(xì)菌這一類微生物基因組拷貝數(shù)的基本特征、解析其基因組的復(fù)制和遺傳分配機(jī)制、協(xié)調(diào)其胞內(nèi)大分子聚合物的時(shí)空格局，在藍(lán)細(xì)菌生物技術(shù)利用方面具有重要意義。

4 展望

原核生物基因組多拷貝現(xiàn)象近年來(lái)被廣泛關(guān)注，進(jìn)化模型分析表明，基因組多拷貝可賦予原核生物短期的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)長(zhǎng)期進(jìn)化而言，基因組多拷貝容易積累隱性有害突變和致死突變。因此，對(duì)基因組多拷貝藍(lán)細(xì)菌而言，必然有其適應(yīng)策略以減少多拷貝的遺傳成本同時(shí)保留其優(yōu)勢(shì)。藍(lán)細(xì)菌家族的低、中、高拷貝特性，使其在基礎(chǔ)研究和生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域均具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。圍繞藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)特征，未來(lái)研究的主體內(nèi)容可能集中在以下幾個(gè)方面：1) 基于生態(tài)學(xué)和生物信息學(xué)的藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的分析和預(yù)測(cè)；2) 藍(lán)細(xì)菌多拷貝基因組的復(fù)制、分配特性，及基因組DNA的時(shí)空分布格局；3) 藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的調(diào)節(jié)和控制機(jī)制；4) 基于藍(lán)細(xì)菌拷貝數(shù)調(diào)控的遺傳改造和生物合成。

建立穩(wěn)定可靠的藍(lán)細(xì)菌基因組拷貝數(shù)的評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)方法，獲得此類微生物基因組拷貝數(shù)的概貌，將從本質(zhì)上加深對(duì)這一光合體系的認(rèn)識(shí)，可為藍(lán)細(xì)菌在分子遺傳、分子生態(tài)和基因工程方面的研究提供理論基礎(chǔ)，必將推動(dòng)綠色微型“細(xì)胞工廠”從“溫室”走向“自然”的進(jìn)程。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress and perspectives on cyanobacterial ploidy

Lina Wang1,2, Jialin Wang1, Tao Zhu2, and Xuefeng Lü2

1 College of Marine Science and Biological Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, Shandong, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

Cyanobacteria are a phylum of bacteria which are believed to be the oldest photosynthetic prokaryotic microorganisms on earth. The phylogenetic group of cyanobacteria was thought to be one of the prokaryotes that contain monoploid, oligoploid and polyploid species, and one obstacle to engineering cyanobacteria is their polyploidy genome. In recent years, the ploidy level of cyanobacteria was found to be influenced by growth phase and by multiple genetic and environmental factors. In the present article, we reviewed the progress, analytical methods and influencing factors on the cyanobacterial ploidy, and discussed the significance of cyanobacterial polyploidy regarding to environmental ecology and biotechnology. Based on this observation, the future research directions in this field are prospected.

cyanobacteria, ploidy, physical and chemical factors, cell factory

December 24, 2017;

February 13, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31570068), Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics (No. SDKLEG201804).

s: Tao Zhu. Tel: +86-532-80662711; E-mail: zhutao@qibebt.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31570068)，山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(No. SDKLEG201804) 資助。

2018-03-06

10.13345/j.cjb.170513

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180306.0833.001.html