LC-MS/MS法快速測定頭發(fā)中可卡因及其代謝物苯甲酰愛康寧

潘美如 ，強火生 ，沈保華 ，嚴(yán) 慧 ，向 平

（1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣東 廣州 510663）

頭發(fā)作為生物檢材，與其他生物樣品相比具有易獲取、易保存、目標(biāo)物穩(wěn)定、檢出時限長、能反映較長時間（幾個月或幾年）的藥物使用情況等優(yōu)點[1]。目前頭發(fā)作為檢材已廣泛應(yīng)用于體內(nèi)濫用藥物的分析。可卡因（cocaine）是常見的違禁濫用藥物之一，屬中樞神經(jīng)興奮劑，其體內(nèi)主要代謝物是苯甲酰愛康寧（benzoylecgonine）[2-3]，其主要毒性表現(xiàn)為對神經(jīng)系統(tǒng)的興奮作用?？煽ㄒ驗E用情況嚴(yán)重，2017年聯(lián)合國全球報告[4]指出，可卡因緝獲量呈增長趨勢，2015年達(dá)到864t。目前，在我國“毒品地下黑市”也已出現(xiàn)可卡因，盡快對其建立快速有效的分析方法是非常必要的?？煽ㄒ蚣按x物苯甲酰愛康寧的分析可采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）[7-8]等方法。近幾年，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法的應(yīng)用越來越受到人們的青睞，與GC-MS法相比具有更廣闊的應(yīng)用前景[9]。頭發(fā)中可卡因和代謝物苯甲酰愛康寧的分析一直是研究熱點之一[6-8]。因為可卡因易分解，可卡因及其代謝物包埋在頭發(fā)角蛋白中，一方面要將目標(biāo)物從頭發(fā)角蛋白中有效釋放出來，另一方面又要防止目標(biāo)物水解，故除了區(qū)分外污染問題[10]，樣品前處理也很關(guān)鍵。本實驗旨在建立簡便、快速的LC-MS/MS法同時測定頭發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧，并將該方法應(yīng)用于實際案例，為司法鑒定中相關(guān)案例的檢驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

API 4000 Q TRAP四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB公司）配備AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色譜儀（美國Waters公司），SB2200-T超聲波清洗儀（美國Branson公司），Centrifuge 5810R冷凍離心機（德國Eppendorf公司），BSA124S電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

可卡因標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL）、苯甲酰愛康寧標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/mL）、可卡因-D3（100μg/mL）和苯甲酰愛康寧-D8（100 μg/mL）購自美國 Cerilliant公司，甲醇（HPLC級）、乙腈（HPLC級）購自美國Sigma-Aldrich公司，乙酸胺（色譜純）和甲酸（優(yōu)級純）購自瑞士Fluka公司，丙酮（分析純）和二氯甲烷（分析純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制得。

1.2 樣本

空白頭發(fā)樣本采集自10名無精神活性物質(zhì)接觸史的健康志愿者。

3例可卡因濫用者陽性頭發(fā)來源于司法鑒定科學(xué)研究院（原司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所）2015年受理的涉毒鑒定案例。貼根剪取濫用者頭頂部頭發(fā)，取根部起0～3cm段（黑色）用于分析。

該研究方案經(jīng)司法鑒定科學(xué)研究院倫理委員會批準(zhǔn)通過。采集樣品前征得本人同意。

1.3 樣品處理

1.3.1 去污處理

將頭發(fā)樣品置于具塞試管中，依次用4 mL去離子水清洗3次、4mL丙酮清洗3次，收集最后一次丙酮溶液，吹干后分析復(fù)溶液以排除外污染因素。取出已處理的頭發(fā)晾干，剪成約1mm段，待檢。

1.3.2 樣品提取

稱取頭發(fā)20mg，置于5mL玻璃試管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液（可卡因-D3和苯甲酰愛康寧-D8，2μg/mL）10 μL，再加入甲醇 0.5 mL，超聲 30 min以釋放目標(biāo)物，然后以離心半徑9.5cm，13 000r/min，離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，供檢。

1.4 儀器條件

色譜條件：液相色譜柱為Restek Allure PFP丙基柱（2.1 mm×100 mm，5 μm），前接 Phenomenex 保護柱（2.1mm×12.5mm，5μm）；流動相為 V（乙腈）∶V（20mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸和 5%乙腈）=80∶20；恒流洗脫 8min，流速為200μL/min；柱溫為室溫；進樣量為5μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源采用正離子模式（ESI+）；離子噴射電壓：5500V；碰撞氣：7psi；氣簾氣：30psi；霧化氣（GS1）：35 psi；輔助氣（GS2）：35 psi；離子源溫度：550℃。采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，各化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1，選用兩個母離子-子離子對進行定性分析，其中一對離子對用于定量分析。

表1 可卡因及其代謝物、內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

1.5 方法學(xué)驗證

1.5.1 選擇性

取10份不同來源的空白頭發(fā)樣本分別按照已建立的方法進行分析，考察頭發(fā)是否干擾目標(biāo)物及其內(nèi)標(biāo)的測定。

1.5.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是LC-MS/MS分析時需考察的指標(biāo)，表現(xiàn)為離子增強或抑制作用。采用PETERS等[11]建議的方法，選取0.02、0.50和9.00ng/mg 3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加樣品，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)6份，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣的峰面積設(shè)為A，空白頭發(fā)按照1.3.2節(jié)處理后加入相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣后的峰面積設(shè)為B，基質(zhì)效應(yīng)=B/A×100%。

1.5.3 線性關(guān)系和檢出限

取空白頭發(fā)20mg，分別加入可卡因和苯甲酰愛康寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，制得 0.02、0.05、0.20、0.50、2.00、5.00 和10.00ng/mg的頭發(fā)樣品，按照1.3.2節(jié)處理，以每個目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)（x），目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），用加權(quán)（W=1/X）最小二乘法進行回歸運算，求得線性方程。以信噪比（S/N）≥3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢出限（limit of detection，LOD），以 S/N≥10的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為定量限（limit of quantification，LOQ）。

1.5.4 精密度和準(zhǔn)確度

取空白頭發(fā)20 mg，添加可卡因和苯甲酰愛康寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制得0.02、0.50和9.00 ng/mg 3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加樣品，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)6份，按照1.3.2節(jié)處理后進樣分析，計算得每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）作為日內(nèi)精密度。連續(xù)4d，計算得每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣品的RSD作為日間精密度。經(jīng)線性方程計算的校正值與實際添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的百分比為準(zhǔn)確度。

1.5.5 穩(wěn)定性

取空白頭發(fā)20 mg，添加可卡因和苯甲酰愛康寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制得0.02、0.50和9.00 ng/mg 3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加樣品，按照1.3.2節(jié)處理后立即進樣，然后每隔2 h進樣1次，以10次進樣的峰面積的RSD評價穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 選擇性

10份不同來源的空白頭發(fā)經(jīng)預(yù)處理后，在待分析化合物對應(yīng)的保留時間窗處均無內(nèi)源性干擾峰出現(xiàn)，說明方法的選擇性良好。

2.1.2 基質(zhì)效應(yīng)

采用本研究建立方法分析，頭發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧的基質(zhì)效應(yīng)均高于92.6%，無明顯基質(zhì)影響（表2）。

表2 方法的基質(zhì)效應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性 （%）

2.1.3 線性關(guān)系和檢出限

頭發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧在0.02～10.00ng/mg質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。線性回歸方程分別為：y=0.026x+0.0034（r=0.9941）和 y=0.018x+0.0038（r=0.9977）。頭發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧的LOD均為0.01ng/mg，LOQ均為0.02ng/mg。

2.1.4 精密度和準(zhǔn)確度

本方法的日內(nèi)和日間精密度均小于8%（表2），準(zhǔn)確度在95.2%～107.9%，表明方法的準(zhǔn)確度及精密度良好，符合生物樣品測定偏倚在±15%的要求。

2.1.5 穩(wěn)定性

在24h內(nèi)10次進樣的RSD值均小于8%（表2），表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.2 案例應(yīng)用

將可卡因濫用者頭發(fā)按照1.3.2節(jié)處理后分析，頭發(fā)的最后一次清洗液中均未檢出苯甲酰愛康寧和可卡因。3例可卡因濫用者頭發(fā)中均檢出苯甲酰愛康寧和可卡因，結(jié)果見表3，苯甲酰愛康寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.41～3.56ng/mg，可卡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76～6.42ng/mg。頭發(fā)中可卡因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于苯甲酰愛康寧。

表3 陽性頭發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果

3 討 論

本研究中頭發(fā)樣品的前處理采用甲醇超聲法。甲醇超聲法是毛發(fā)樣品處理的常用方法之一，雖然與毛發(fā)完全消解的堿水解方法相比釋放不夠完全[7]，但不會造成可卡因的分解，另一方面，減少了毛發(fā)基質(zhì)對之后LC-MS/MS法檢測的干擾。

本研究毛發(fā)經(jīng)甲醇超聲后直接進樣，快速、簡便，而且可減少提取處理的誤差。采用氘代內(nèi)標(biāo)可卡因-D3和苯甲酰愛康寧-D8，其與分析物相似的理化性質(zhì)有效降低了測定的隨機誤差，方法的精密度和準(zhǔn)確度均較好。

根據(jù)國際毛發(fā)分析協(xié)會（Society of Hair Testing，SOHT）的建議，進行毛發(fā)分析時，可卡因和苯甲酰愛康寧的確認(rèn)分析cutoff值分別為0.50 ng/mg和0.05ng/mg，本研究采用LC-MS/MS法的MRM模式進行分析，所建立的方法LOQ均為0.02 ng/mg，可滿足要求。

與THIBERT等[12]報道的LC-MS法檢測可卡因和苯甲酰愛康寧的LOD（0.07 ng/mg）相比，本研究建立的LC-MS/MS快速測定法具有靈敏度高、進樣量少、樣品處理簡便、操作簡單快速的優(yōu)勢。本研究中可卡因和苯甲酰愛康寧的LOD均為0.01ng/mg，比POLLA等[13]研究頭發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧的LOD分別為0.50ng/mg和0.05ng/mg要低。本研究的靈敏度較高，可滿足實際案例頭發(fā)中微量可卡因和苯甲酰愛康寧的分析要求，適用于快速測定分析。

3例可卡因濫用者頭發(fā)樣品中可卡因含量均高于苯甲酰愛康寧，與文獻(xiàn)[14]報道一致。藥物進入毛發(fā)與藥物本身的理化性質(zhì)密切相關(guān)，親脂性越強越容易進入毛發(fā)。代謝物苯甲酰愛康寧結(jié)構(gòu)上含有羧酸基團，極性增強，相對可卡因難以進入毛發(fā)。

可卡因的頭發(fā)分析中需要排除煙霧、被動接觸等外污染的可能，按照SOHT的建議，苯甲酰愛康寧與可卡因的濃度比值應(yīng)大于0.05。本研究所分析實際案例中樣品苯甲酰愛康寧與可卡因的比值分別為0.55、0.54和0.32，均大于0.05，因此，可排除外污染干擾，進行陽性認(rèn)定。

我國實驗室在可卡因的頭發(fā)分析中還需要更多的數(shù)據(jù)積累。首先，毛發(fā)中藥物濃度與毛發(fā)中黑色素含量密切相關(guān)[15]，目前的高加索人淺色頭發(fā)資料無法簡單應(yīng)用于亞洲黑色頭發(fā)人群；其次，毛發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧的含量及其比值與樣品前處理方法密切相關(guān)，不同的前處理方法，如酸水解、堿水解和甲醇浸泡方法，可導(dǎo)致非常大的差別[16-17]。

本研究采用甲醇超聲提取的前處理方法，簡便快速。所建立的頭發(fā)中可卡因和苯甲酰愛康寧的LCMS/MS測定方法，靈敏度高，LOD均為0.01 ng/mg。3例陽性頭發(fā)樣本中均同時檢出可卡因和苯甲酰愛康寧，且可卡因含量均高于苯甲酰愛康寧。該方法可在涉毒、交警部門駕照重新申領(lǐng)、高危職業(yè)監(jiān)督等檢測中發(fā)揮快速、準(zhǔn)確、高效的作用。