王帥，周迎松，張晉

1.寧波市第二醫(yī)院，浙江 寧波 315000；2.寧波大學(xué)體育學(xué)院，浙江 寧波 315000

腦缺血性疾病(Ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是較常見的腦血管疾病，我國患該病的人數(shù)也在逐年上升[1～2]。臨床上，ICVD主要會引起原發(fā)的缺血性腦損傷和再灌注腦損傷。兩種損傷機(jī)制會在不同時(shí)間和程度上導(dǎo)致患者腦組織出現(xiàn)功能障礙，尤其是腦缺血再灌注對腦細(xì)胞造成的損傷，逐漸受到臨床醫(yī)師的重視。腦缺血再灌注損傷是指對腦缺血患者采用醫(yī)療手段，對腦血管閉塞的腦組織進(jìn)行再通后，導(dǎo)致的腦組織損傷現(xiàn)象[3]。腦缺血再灌注損傷主要出現(xiàn)于缺血性腦損傷的后期，引起一系列腦組織受損及神經(jīng)系統(tǒng)病變。隨著專家學(xué)者對腦缺血再灌注損傷機(jī)制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、自由基過度形成、細(xì)胞內(nèi)鈣超量和氨基酸的毒性作用等是引起該病的主要原因[4]。

一氧化氮合酶(NOS)是一種催化一氧化氮合成的酶，共分為神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)3種亞型[5]。eNOS與nNOS合稱結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)，表達(dá)過程需要鈣離子介導(dǎo)，iNOS則不需要。3種NOS亞型在腦缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)表達(dá)于不同的部位和時(shí)間[6]。NOS能夠催化NO生成，從而引起腦組織內(nèi)的氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)還可以改變血腦屏障通透性，從而加重神經(jīng)損傷[7]。研究顯示，nNOS大量表達(dá)于腦缺血損傷早期，損傷后期其表達(dá)量逐漸降低；iNOS大量表達(dá)于腦缺血損傷后期，在損傷早期極少甚至不表達(dá)；eNOS主要在再灌注早期表達(dá)，具有保護(hù)神經(jīng)的作用[8～9]。本研究將探索血府逐瘀膠囊是否能夠在腦缺血再灌注損傷時(shí)起腦保護(hù)作用，及3種NOS亞型的表達(dá)水平與其作用機(jī)制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 165只雄性SPF級SD大鼠，鼠齡8～10周，體質(zhì)量均在250～300 g之間，由上海南方模式動物中心提供，合格證號：SCXK(滬)2017-0016，在溫度為20～25℃的單籠動物房中飼養(yǎng)，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)將165只大鼠分為模型組37只、假手術(shù)組21只和血府逐瘀膠囊低、中、高劑量預(yù)處理組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)共107只。

1.2 主要試劑與儀器 抗體：兔抗鼠eNOS多克隆抗體、兔抗鼠nNOS多克隆抗體以及兔抗鼠iNOS多克隆抗體(北京博奧森公司)，二甲苯(國藥試劑)，過氧化氫(天津化學(xué)試劑公司)，多聚甲醛(上?；瘜W(xué)試劑公司)、組織切片機(jī)(德國Leitz公司)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)。

1.3 藥品配置及給藥方法 用生理鹽水將血府逐瘀膠囊粉末配制為 0.1 g/(kg·d)、0.2 g/(kg·d)、0.5 g/(kg·d)的混懸液，以 55 kg為標(biāo)準(zhǔn)成人體重，低劑量組給藥量為成人劑量的1倍，中劑量組給藥量為成人劑量的3倍，高劑量組給藥量為成人劑量的5倍。術(shù)前7 d按照低、中、高3種劑量對預(yù)處理組大鼠進(jìn)行灌胃給藥，10 mL/(kg·d)；給予缺血再灌注組和假手術(shù)組大鼠同等劑量的生理鹽水，并在最后1次給藥2 h后制備大鼠腦缺血再灌注模型。

1.4 模型制備及評分 改良Longa法制備大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)再灌注模型：將各組大鼠進(jìn)行標(biāo)記并做好術(shù)前準(zhǔn)備；按照3 mL/kg的劑量使用水合氯醛(10%)對大鼠進(jìn)行麻醉；大鼠取仰臥位，切開皮膚并分離出大鼠的右側(cè)頸總動脈和頸外動脈以作掛線用，同時(shí)分離出大鼠的頸內(nèi)動脈以便于后期插線使用；先用夾子關(guān)閉大鼠的頸內(nèi)動脈，而后在頸總動脈的近心端進(jìn)行結(jié)扎，同時(shí)結(jié)扎頸外動脈。隨后沿著頸總動脈將拴線插入頸內(nèi)動脈，深度自分叉部開始計(jì)算約18 mm，將拴線末端留長以便于抽出；拴線插入假手術(shù)組大鼠模型的深度約9 mm，此時(shí)暫不夾閉大腦中動脈，只在頸內(nèi)動脈的近心端結(jié)扎，而后縫合切口；再灌注過程，需將魚線向外抽出約10 mm，保持環(huán)境溫度在25℃；等待大鼠蘇醒，然后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。分別于缺血再灌注2、5、10、20、48 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠并制作腦組織標(biāo)本。

根據(jù)Longa EZ等[10]研究出的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，開始評分時(shí)間為缺血2 h再灌注24 h后(0分：可正?；顒樱闯霈F(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：出現(xiàn)輕微的神經(jīng)功能損傷癥狀，即提起尾部時(shí)大鼠左前肢無法完全伸直；2分：出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷癥狀，即向左側(cè)轉(zhuǎn)圈爬行；3分：出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷癥狀，即爬行時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷癥狀，即無法正常爬行甚至出現(xiàn)暈厥；5分：死亡)，篩選出評分為1～3分的大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，剔除該過程中結(jié)果不符合要求和死亡的大鼠，并重新制備模型補(bǔ)充至相應(yīng)組別，各組隨機(jī)抽取7只大鼠檢測各指標(biāo)。

1.5 制備腦組織切片 大鼠腦缺血再灌注模型制備完成后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)在各時(shí)間點(diǎn)將大鼠麻醉后打開胸腔，開始灌注，針頭需從大鼠的左心室進(jìn)入到升主動脈，將針頭固定好，然后剪開大鼠的右心耳。用0.9%氯化鈉對假手術(shù)組及缺血再灌注組模型進(jìn)行灌注5 min(約150 mL)來排出大鼠體內(nèi)的血液，當(dāng)大鼠的肝臟開始發(fā)白并且其右心房流出無色液體時(shí)說明灌注完成。灌注試劑：用大約400 mL的濃度為4%、pH為7.4的多聚甲醛磷酸緩沖液對大鼠進(jìn)行灌注，當(dāng)大鼠的肝臟開始發(fā)硬并且全身肌肉僵硬時(shí)說明灌注完成。灌注完成后斷頭處死取出腦組織，并使用4%多聚甲醛固定24 h。將固定好的腦組織切片，厚度為2～3 cm，置于包埋盒內(nèi)，先使用清潔自來水進(jìn)行沖洗，而后按照50%乙醇4 h、70%乙醇4 h、80%乙醇12 h、95%乙醇1 h、95%乙醇1 h、無水乙醇1 h和無水乙醇30 min的梯度次序進(jìn)行脫水。透明：先在二甲苯中放置20 min，再在二甲苯中放置10 min，使腦組織完全透明。將石蠟融化并過濾(60℃)，按照浸蠟1 h后，再浸蠟30 min的順序?qū)δX組織進(jìn)行處理。將腦組織放入金屬包埋框內(nèi)，加入石蠟液覆蓋，將包埋盒輕輕放在上面，置于冷凍臺進(jìn)行冷卻，冷卻完成后將石蠟?zāi)X組織塊進(jìn)行標(biāo)記。將石蠟?zāi)X組織塊邊緣修剪整齊，固定至載物臺上，將切片裝置厚度調(diào)整為4 μ m。用毛筆托起蠟帶1端，用鑷子將蠟帶放入45℃水中，在水中用鑷子將蠟帶分開，充分展開腦組織，然后用經(jīng)過多聚賴氨酸處理的載玻片將蠟帶撈起，立即放入60℃的烤箱烤48 h備用。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 實(shí)驗(yàn)開始前將所需要的石蠟切片放入65℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥1～6 h。脫蠟：將干燥后的石蠟切片依次浸于二甲苯中2次，各10 min。梯度乙醇水化：將石蠟切片依次浸于100%酒精中2次，各10 min、95%酒精中2次各10 min、90%酒精中10 min、85%酒精中5 min。清洗：將石蠟切片依次置于事先配好的0.1 mol/L PBS磷酸緩沖液2次，各3 min。將石蠟切片浸于剛配好的3%的過氧化氫溶液中15 min以便去除內(nèi)源性過氧化物酶，而后再依次浸于0.1 mol/L的PBS磷酸緩沖液中3次，各3 min?？乖迯?fù)：先將石蠟切片浸于pH為6.0的檸檬酸鹽緩沖液中，然后將高壓鍋溫度設(shè)置為270℃預(yù)熱。水沸騰后，將帶有石蠟切片的檸檬酸鹽緩沖液一起放入高壓鍋，關(guān)嚴(yán)鍋蓋并繼續(xù)加熱，高壓鍋噴氣后將溫度重新設(shè)置為140℃，1.5 min后關(guān)閉電源，取出石蠟切片置于冷卻臺，使切片冷卻至室溫，而后將切片放入PBS磷酸緩沖液中清洗3次，各3 min。滴加均已被稀釋為1∶400的兔抗鼠iNOS、eNOS和nNOS抗體(一抗)，將切片放入濕盒，在4℃冰箱內(nèi)過夜孵育。將濕盒取出并晾至室溫，將石蠟切片依次置于PBS磷酸緩沖液中3次，各4 min。滴加經(jīng)過標(biāo)記(生物素)的兔PV-6001(二抗)，37℃孵育40 min，取出后置于PBS磷酸緩沖液中清洗3次，各4 min。DAB顯色：滴加DAB顯色劑，將切片背景染為淺棕色(光鏡下)即可停止顯色，然后用清潔自來水水化20～30 min。使用蘇木素對切片復(fù)染10 s并返藍(lán)40 min。將切片放入梯度酒精進(jìn)行脫水，再次使用二甲苯透明切片，最后用中性樹膠對切片進(jìn)行封片，置于顯微鏡下觀察。對照組：只需使用PBS磷酸緩沖液來代替一抗進(jìn)行免疫染色，作為陰性對照，其余步驟均相同。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用(±s)表示，組間比較用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果比較 見表1。假手術(shù)組大鼠在研究期間均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失的癥狀，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在24 h后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀(P＜0.05)；與低劑量組比較，中、高劑量組大鼠的神經(jīng)行為評分顯著降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果比較(±s) 分

表1 各組大鼠神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果比較(±s) 分

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n7777724 h 02.67± 0.57①2.15± 0.44②1.48± 0.37②③1.13± 0.35②③48 h 03.08± 0.61①2.36± 0.48②1.64± 0.41②③1.28± 0.39②③

2.2 各組大鼠腦組織eNOS蛋白表達(dá)結(jié)果比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織切片中各時(shí)間點(diǎn)eNOS陽性表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)，在腦缺血再灌注后10 h時(shí)達(dá)到最大值，相比于其他時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠eNOS的陽性表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)，其中在高劑量組大鼠eNOS陽性表達(dá)最高。

2.3 各組大鼠腦組織n NOS蛋白表達(dá)結(jié)果比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織切片中各時(shí)間點(diǎn)nNOS陽性表達(dá)均顯著減少(P＜0.05)，在腦缺血再灌注后的第10 h時(shí)達(dá)到最大值，相比于其他時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組nNOS陽性表達(dá)均顯著下降(P＜0.05)，其中高劑量組大鼠nNOS陽性表達(dá)最低。

表2 各組大鼠腦組織e N O S蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s) ppm

表2 各組大鼠腦組織e N O S蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s) ppm

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05；與同組其他時(shí)間點(diǎn)比較，④P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 7 7 7 7 72h 1.77±0.212.46±0.26①2.97±0.31②3.58±0.53②③6.51±0.74②③5h 1.96±0.325.11±0.16①7.14±0.29②8.05±0.46②③9.16±0.53②③10h 4.15±0.48④10.20±0.59①④14.05±0.69②④16.21±0.74②③④15.86±0.43②③④20h 2.51±0.374.17±0.29①6.42±0.18②6.83±0.22②③7.01±0.26②③48 h 1.43±0.121.06±0.13①2.14±0.08②2.21±0.16②③2.52±0.11②③

表3 各組大鼠腦組織n N O S蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s) ppm

表3 各組大鼠腦組織n N O S蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s) ppm

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05；與同組其他時(shí)間點(diǎn)比較，④P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 7 7 7 7 72h 1.32±0.253.47±0.21①3.22±0.30②3.02±0.31②③2.47±0.23②③5h 1.74±0.214.34±0.17①4.01±0.18②3.69±0.20②③3.25±0.23②③10h 4.28±0.31④9.11±0.27①④8.28±0.24②④6.75±0.34②③④5.89±0.26②③④20h 2.32±0.284.73±0.25①4.05±0.19②3.23±0.17②③2.87±0.20②③48 h 1.47±0.112.67±0.08①2.31±0.12②2.02±0.10②③1.83±0.07②③

2.4 各組大鼠腦組織iNOS蛋白表達(dá)結(jié)果比較 見表4。假手術(shù)組的大鼠腦組織未檢測到iNOS陽性表達(dá)，模型組大鼠中檢測iNOS陽性表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著缺血再灌注后時(shí)間的延長而逐漸升高；與模型組比較，低、中、高劑量組中iNOS陽性表達(dá)均顯著下降(P＜0.05)，與低劑量組比較，中、高劑量組大鼠iNOS的表達(dá)較低(P＜0.05)。

表4 各組大鼠腦組織iN O S蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s) ppm

表4 各組大鼠腦組織iN O S蛋白表達(dá)結(jié)果比較(±s) ppm

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 7 7 7 7 72h 01.56±0.21①1.32±0.17②1.10±0.11②③1.06±0.14②③5h 03.87±0.29①2.91±0.19②2.59±0.24②③2.31±0.27②③10h 07.74±0.38①6.86±0.41②6.45±0.33②③5.87±0.37②③20h 011.12±0.51①10.37±0.49②9.42±0.57②③9.51±0.43②③48 h 015.71±0.68①12.43±0.71②12.07±0.64②③10.89±0.72②③

3 討論

ICVD在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重威脅著人類健康，人們也越來越重視對它的防治。腦組織發(fā)生缺血性損傷是由于腦組織血供減少引起微循環(huán)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織發(fā)生缺血缺氧性壞死。及時(shí)有效恢復(fù)腦部血供是治療此病的關(guān)鍵，但同時(shí)會導(dǎo)致腦缺血后的再灌注損傷，進(jìn)一步加重腦組織損傷。腦缺血再灌注損傷是指對腦缺血患者再灌注引起的病理事件，腦血管出現(xiàn)阻塞后的首發(fā)表現(xiàn)是腦組織發(fā)生缺血性損傷，經(jīng)過治療后血管再通，恢復(fù)腦組織血供，反而加重腦細(xì)胞損傷[11]。腦部的缺血癥狀雖然得到了改善，但卻會加重腦細(xì)胞損傷程度，引起遲發(fā)型神經(jīng)損傷，非常不利于患者預(yù)后[12]。腦缺血再灌注損傷的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜、互相聯(lián)系，共同影響著再灌注對腦組織的損傷。近年來，相關(guān)專家學(xué)者對其機(jī)制進(jìn)行不斷研究，發(fā)現(xiàn)NOS在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用。但NOS具有多種亞型，表達(dá)于不同時(shí)間、部位，所以對腦組織的影響也不盡相同[9]。

NOS是一種催化NO生成的限速酶，正常情況下腦組織中的NO濃度處于較低的納摩爾水平，但腦組織發(fā)生缺血性損傷后會激活NOS表達(dá)，進(jìn)而使NO濃度升高達(dá)到微摩爾水平。目前人們研究出的NOS共有2類3型，一類cNOS，需要依靠鈣離子才能表達(dá)，另一類是iNOS，不需要鈣離子即可表達(dá)，并且只有在神經(jīng)受損后才會表達(dá)[10]。由于不同亞型NOS的表達(dá)部位、規(guī)律均不相同，所以其在腦缺血性損傷過程中共有以下兩方面作用：由eNOS介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)功能和早期由nNOS介導(dǎo)、晚期由iNOS介導(dǎo)的神經(jīng)毒性功能。

血府逐瘀膠囊主要由當(dāng)歸、川芎、紅花等組成，有行氣活血化瘀的功效[13]。臨床上常用于瘀血證的治療，近年來也常用于腦中風(fēng)的治療。瘀血是造成缺血性中風(fēng)的常見病因病機(jī)，瘀血阻滯，脈絡(luò)不行，腦髓失養(yǎng)，進(jìn)而加重病情，方中桃仁、紅花、川芎、當(dāng)歸、赤芍活血祛瘀，當(dāng)歸、生地黃養(yǎng)血化瘀，柴胡、枳殼理氣，牛膝活血通經(jīng)，引血下行，桔梗載藥上行，甘草調(diào)和諸藥，共奏活血祛瘀、理氣通絡(luò)之功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，本方具有擴(kuò)張血管增加缺血器官血流量、抑制血栓形成、抗凝、抑制動脈硬化等作用[14]。本研究采用血府逐瘀膠囊對腦缺血再灌注大鼠模型進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)其在保護(hù)腦缺血再灌注損傷過程中起著重要作用。預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)的eNOS陽性表達(dá)均明顯增加，尤其是高劑量組的增加最顯著，因而我們可以推測血府逐瘀膠囊在腦缺血再灌注中，可能通過提高腦組織中eNOS的表達(dá)水平，起到神經(jīng)保護(hù)的功能。同時(shí)血府逐瘀膠囊能夠影響nNOS在再灌注損傷早期的表達(dá)，血府逐瘀膠囊的預(yù)處理能夠降低nNOS在缺血再灌注損傷早期的表達(dá)。另外，nNOS在早期的神經(jīng)損傷過程中起一定作用，所以降低其產(chǎn)生能夠起到一定的腦細(xì)胞保護(hù)作用。血府逐瘀膠囊預(yù)處理組在各時(shí)間點(diǎn)iNOS染色陽性表達(dá)均明顯降低，以高劑量組降低最為顯著，表明血府逐瘀膠囊預(yù)處理能夠降低腦組織損傷過程中iNOS的陽性表達(dá)，從而降低iNOS介導(dǎo)的遲發(fā)性神經(jīng)損傷，與之前報(bào)道也較為一致[15]。

綜上，在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中，3種NOS亞型在不同時(shí)期的表達(dá)發(fā)揮著重要作用；通過血府逐瘀膠囊的預(yù)處理，可影響NOS亞型在腦組織的表達(dá)，從而提示血府逐瘀膠囊可能是通過影響NOS亞型的表達(dá)來發(fā)揮對腦組織的保護(hù)功能。